Detección y caracterización de Brettanomyces bruxellensis y Trigonopsis cantarellii en el contexto enológico stars

Resumen

Brettanomyces/Dekkera es la principal causa de las alteraciones microbiológicas que actualmente pueden sufrir los vinos, y especialmente los vinos tintos de calidad que deben ser sometidos al proceso de crianza en barricas de madera. Esta levadura es responsable de cuantiosas pérdidas económicas de la industria enológica en todos los países productores del mundo. El primer objetivo de esta tesis fue poner a punto el método rápido de PCR cuantitativa (qPCR) para la detección y cuantificación de células de Brettanomyces/Dekkera en muestras vinos tintos tomadas en distintos momentos de su elaboración y conservación, así como de otras muestras de bodega que tuvieran interés para el enólogo. El primer hito alcanzado en el trabajo fue eliminar la grave interferencia que suponen las partículas sólidas de agregados macromoleculares y compuestos polilfenólicos presentes en un vino no acabado y que son responsables de la inhibición de la reacción de la DNA polimerasa. Conseguida la puesta a punto del método de qPCR, se realizó el estudio comparativo con el método clásico de cultivo microbiológico en un medio selectivo, empleándose para ello un total de 324 muestras de vinos tintos de la variedad Tempranillo provenientes de las denominaciones de origen Rioja y Ribera del Duero, recogidas en el periodo 2009 - 2011. El estudio estadístico comparativo presentó una buena correlación entre los resultados obtenidos por los dos métodos, poniéndose de manifiesto la mayor especificidad del método rápido de qPCR, en el que no se encontraron resultados falsos positivos y se alcanzó el límite de detección y cuantificación entre 16 - 25 células de Brettanomyces/mL en vinos tintos con turbidez y en presencia de hasta 7,5 105 UFC/mL de levaduras de otras especies. El método clásico de cultivo microbiológico en medio selectivo permitió detectar y cuantificar hasta 1 UFC/mL de células viables de Brettanomyces/Dekkera en los vinos y además permitió la detección de Brettanomyces/Dekkera en el aire de bodega. El siguiente objetivo fue estudiar la sensibilidad de Brettanomyces/Dekkera a distintos agentes antimicrobianos de uso en enología para determinar el método más eficaz de combatir esta levadura alterante. Los agentes antimicrobianos que se estudiaron fueron: metabisulfito potásico (MBP), solución de taninos enológicos, chitosan y dicarbonato de dimetilo (DMDC). Dentro de los respectivos rangos de concentraciones de uso permitido en enología, el agente que presentó la mayor especificidad para Brettanomyces/Dekkera fue el chitosan, y el agente que mostró la mayor eficacia fue el MBP, presentando actividad inhibidora del crecimiento y también biocida frente a la totalidad de las cepas estudiadas (CMI90 y CMB90= 48 mg/L, en presencia de 12,5 % etanol en el medio). Este agente se empleó posteriormente para el estudio en vino tinto contaminado de forma natural por Brettanomyces/Dekkera y conservado en botella en condiciones de bodega. Se pudo demostar una correlación directa entre la población de células de Brettanomyces/Dekkera (UFC/mL) y el aumento de la concentración de los fenoles volátiles (4-etilguaiacol, 4-etilfenol, 4-vinilfenol y 4-propilguaiacol) en el vino, quedando totalmente excluida la posibilidad de que bacterias lácticas u otros microorganismos fueran los responsables de la producción de estos compuestos. Una concentración de 100 mg/L de MBP se mostró plenamente eficaz y evitó el crecimiento de Brettanomyces/Dekkera y por tanto también el aumento de los fenoles volátiles en los vinos estudiados. En esta tesis además se identificaron las siguientes especies de levaduras del orden Saccharomycetales presentes en muestras de vinos en proceso de crianza en barricas de madera, recogidas en el periodo 2008 - 2011 y sospechosas de contaminación por análisis sensorial con indicios de cierta desviación aromática: Pichia mandshurica, Pichia holstii, Trigonopsis cantarelli, Trigonopsis variabilis y Arthroascus schoenii. La especie más recurrente resultó ser T. cantarellii, representando el 54,5 % de los aislados estudiados. Se caracterizó esta levadura, comprobándose su capacidad de crecer en vinos tintos secos (< 0,2 g/L de azúcares reductores) con un alto contenido en etanol (hasta 13,8 %) y su mayor resistencia al MBP que la de Brettanomyces/Dekkera. Las levaduras de la especie T. cantarelli mostraron un crecimiento lento, y la capacidad potencialmente alterante de generar ácidos se demostró en un 48 % de las cepas estudiadas, así como el potencial de generar aromas alterantes en un 72 % de las cepas, si bien con un potencial alterante aromático menor que el detectado habitualmente en Brettanomyces/Dekkera.