Molecular analysis of the interactions between starter cultures during wine fermentation stars

Resumen

Durante los últimos años, la industria del vino se está enfrentando a retos importantes como el cambio climático, una de cuyas consecuencias es el aumento de la concentración de azúcares en la uva en el momento de la vendimia y, por consiguiente, del grado alcohólico en los vinos. Por otra parte, el uso generalizado de cepas de Saccharomyces cerevisiae como iniciadores de la fermentación ha llevado a una percepción de uniformidad o estandarización del perfil aromático de los vinos. En ambos casos, parte de las propuestas para la reducción del grado alcohólico y la diversificación de productos pasan por el uso de cultivos iniciadores de especies alternativas a S. cerevisiae, comúnmente denominados como no-Saccharomyces. Estos nuevos cultivos iniciadores se combinan habitualmente con alguna cepa de S. cerevisiae, con el fin de evitar paradas de fermentación. El uso de más de una especie como cultivo iniciador, supone que haya más de una población con un número similar de individuos que realizan el proceso de fermentación simultáneamente. De esta manera, las interacciones que se establecen entre ellas adquieren una relevancia que hasta ahora no había sido valorada. Hoy en día, está ampliamente aceptado que el resultado de un proceso de fermentación en el que participan dos o más especies de levaduras inoculadas será diferente de la media ponderada de los correspondientes cultivos individuales. Las interacciones interespecíficas entre las levaduras del vino tienen lugar a varios niveles, incluyendo la competencia por interferencia, la competencia por explotación y el intercambio de intermediarios metabólicos, entre otros. Algunas interacciones podrían ser una simple consecuencia del metabolismo de cada levadura en un contexto en el que están presentes los intermediarios metabólicos y los productos finales de otras levaduras. Sin embargo, hay indicios claros, en algunos casos, de un reconocimiento específico entre las levaduras que interactúan. De forma general, esta tesis doctoral pretende profundizar en el conocimiento de cómo se comportan las comunidades microbianas en el vino, analizando dicho comportamiento principalmente desde un punto de vista transcriptómico y proteómico, tratando de anticipar sus respuestas biológicas en esta compleja matriz. En este sentido, el primer capítulo de la tesis se centra en el impacto práctico que conlleva el utilizar levaduras enológicas que presentan el elemento prion [GAR+] en la fermentación del mosto natural de uva. Se evalúan parámetros como la reducción real de alcohol, la acidez volátil producida, la cinética y tiempo de fermentación, tanto en condiciones aerobias como anaerobias. Además, se analiza la frecuencia de aislamiento, la heredabilidad y valores de penetrancia de este tipo de prion en seis cepas industriales de S. cerevisiae con diferentes fondos genéticos. Entre los resultados principales se destaca la baja penetrancia fenotípica de este elemento epigenético, y la ausencia de reducción del rendimiento alcohólico. El segundo capítulo de la tesis se centra en el estudio de las interacciones levadura-levadura a corto plazo para evitar que los cambios en la composición de nutrientes afecten a la actividad metabólica de la levadura. Se ha evaluado la respuesta transcripcional de S. cerevisiae al co-cultivo, en tan solo tres horas, con la levadura Metschnikowia pulcherrima. Además, se han comparado las respuestas obtenidas en este capítulo con las obtenidas en un trabajo anterior realizado por este grupo de investigación en el que se analizaba la respuesta a corto plazo también de S. cerevisiae, pero frente al co-cultivo con levaduras de las especies Torulaspora delbrueckii, Candida sake y Hanseniaspora uvarum. Los resultados muestran que S. cerevisiae responde a M. pulcherrima de una manera más intensa que a otras especies de levaduras, implicando una represión de la actividad respiratoria, además de la inducción de la glicolisis, que es común a todas las respuestas analizadas. Por su parte, el tercer y cuarto capítulo de esta tesis doctoral se centran en el estudio de las vesículas extracelulares (VEs) como estructuras complejas con potencial participación en los procesos de comunicación entre células de levadura en condiciones de fermentación enológica. Concretamente, en el tercer capítulo no sólo se evalúa si las levaduras enológicas son capaces de producir VEs en un contexto enológico, sino que también se pretende analizar qué proteínas están mayoritariamente presentes en las fracciones enriquecidas en VEs mediante un análisis proteómico. Dicho estudio ha demostrado, de acuerdo con lo descrito en bibliografía, un enriquecimiento en proteínas relacionadas con la pared celular y la glicolisis. Además de la hipótesis de que las VEs actúan como portadoras de señales en las interacciones entre diferentes especies de levaduras vínicas, en el cuarto capítulo de esta tesis doctoral se evalúa si el contenido de proteínas de las VEs se ve, a su vez, afectado por dichas interacciones. Los resultados muestran un claro impacto del co-cultivo sobre la composición proteica en todos los casos. Además, aunque no se puede concluir fírmemente, sí que existen indicios de que algunas levaduras muestran factores comunes en su respuesta a diferentes competidoras, mientras que otras inducen en otras levaduras una respuesta que muestra algún factor común entre varias de ellas. En conjunto, los resultados mostrados en estos dos últimos capítulos apuntan a un potencial papel de las VEs en la comunicación entre diferentes especies de levaduras enológicas. En términos generales, esta tesis doctoral contribuye no sólo al conocimiento fundamental de las interacciones ecológicas a largo plazo, sino que también permite vislumbrar su potencial aplicabilidad industrial. En este sentido, un conocimiento preciso de los mecanismos de interacción permitiría diseñar nuevos cultivos iniciadores mixtos basados en levaduras Saccharomyces y no-Saccharomyces, así como las condiciones óptimas para su aplicación.