Factores de virulencia de Pseudomonas aeruginosa de origen clínico, animal, alimentario y ambiental

Resumen

Pseudomonas aeruginosa es una bacteria ubicua, patógeno oportunista y con una alta versatilidad metabólica. Este patógeno presenta resistencia intrínseca y elevada capacidad de adquirir mecanismos de resistencia, producción de biofilm y un amplio arsenal de mecanismos de virulencia que dificultan su erradicación. Sin embargo, pese al impulso del concepto One Health, la mayoría de los estudios en esta especie se han realizado sobre aislados clínicos. La finalidad principal de esta tesis fue analizar los marcadores genéticos y biológicos implicados en virulencia, patogenicidad, resistencia a antibióticos y clonalidad que favorecen la diversidad y éxito de P. aeruginosa. Por ello, el primer objetivo fue caracterizar los factores de virulencia, los parámetros biológicos de patogenicidad, la resistencia a antibióticos y la diseminación clonal de 275 cepas de P. aeruginosa, tanto clínicas (respiratorias, sangre, orina y otros orígenes como exudados de heridas) como no clínicas (individuos sanos, animales, alimentos y medioambientales). De ellas, un 64% resultaron sensibles a todos los antipseudomónicos testados, un 15% se clasificaron como modR, un 18% MDR y un 3% XDR, mostrando diferentes fenotipos de resistencia en función del origen. El serotipo no tipable (30%) fue el más frecuente, siendo más prevalente en las cepas de origen clínico, seguido de O:6 (19%), O:1 (12%), O:3 y O:11 (8% cada uno). Se demostró la elevada variabilidad de esta población al clasificarse las 275 cepas en 245 pulsotipos diferentes mediante PFGE (221 pulsotipos únicos) y en 127 STs diferentes mediante MLST (95 STs en las cepas no clínicas y 49 STs en las clínicas), siendo ST235, ST253, ST274, ST175, ST244 y ST973 los más prevalentes y 27 STs nuevos. Por otro lado, un 67% de las cepas presentaron el genotipo exoS+/exoU- y el 28% el genotipo exoS-/exoU+. Además, se detectaron otros genotipos menos comunes: exoS+/exoU+ (1%) y exoS-/exoU- (4%) en cepas de origen no clínico. Nueve cepas que carecían del sistema de secreción tipo III (T3SS) poseían la exolisina ExlA. Se observaron asociaciones STs-serotipo-efector T3SS, como ST235-O:11-exoU; ST175-O:4-exoS; ST274-O:3-exoS; ST245-O:5-exoS, ST17-O:1-exoS ó ST155-O:6-exoS. La caracterización de los parámetros biológicos mostró que las cepas no clínicas presentaban mayor producción de biofilm y pigmentos (piocianina principalmente), actividad elastasa y motilidad que las cepas clínicas, pero además esas características eran inversamente proporcionales a la resistencia a antibióticos o a quorum sensing afuncionales, lo que favorece su adaptación a diferentes entornos. El segundo objetivo fue analizar la resistencia a fluoroquinolonas y presencia de mecanismos asociados a la misma, en una selección de 56 cepas de P. aeruginosa de origen clínico y no clínico. Veintidós cepas (37%) mostraron resistencia a, al menos, una fluoroquinolona. Se observó una correlación entre el número de cambios en las proteínas GyrA y ParC y el nivel de resistencia a fluoroquinolonas. Se detectó también sobreexpresión de bombas de expulsión asociada con alteraciones o ausencia de genes como mexZ, mvaT y nalD. El gen crpP se observó en 43 cepas (72.9%) (49% sensibles a fluoroquinolonas y 40% no clínicas), codificando siete variantes diferentes de CrpP, incluida una nueva (CrpP-7). Este gen se localizó en 23 elementos móviles integrativos y conjugativos (ICEs) cromosómicos diferentes, que contenían otros elementos de interés como piocinas o determinantes de resistencia a metales. El clon de alto riesgo epidémico internacional ST274 está asociado con entornos hospitalarios y pacientes con fibrosis quística en todo el mundo. Por lo que el tercer objetivo fue caracterizar 11 cepas ST274 de origen clínico y no clínico. Las cepas XDR/DTR, modR y con lasR truncado mostraron un fenotipo de infección crónica caracterizado por la pérdida de antigenicidad específica de serotipo y baja motilidad. Además, las cepas XDR/DTR y modR presentaron una baja producción de pigmentos y formación de biofilm, mientras que fue muy alta en la cepa lasR-truncada. El análisis de los genomas de las cepas, junto con otras catorce P. aeruginosa-ST274 disponibles en la base de datos, mostraron ciertas asociaciones como la presencia de los genes blaOXA-486 y blaPDC-24, serotipo O:3, genotipo exoS+/exoU−, el grupo V de pili tipo IV, el locus de pioverdina clase II y patrones mutacionales en proteínas como PmrAB, ToxA, FusA2 o AmpD. Finalmente, existen clones de alto riesgo (CAR) particularmente comunes entre los aislados clínicos MDR/XDR y ampliamente diseminadas a nivel internacional, que también se detectaron en esta tesis. Por lo que el cuarto objetivo fue analizar las características biológicas y los marcadores moleculares de todas las cepas resistentes a imipenem y pertenecientes a los CAR ST175, ST235, y ST973. En general presentaron fenotipos MDR/XDR, baja producción de pigmentos, de biofilm y de actividad elastasa, así como una motilidad defectiva. El análisis del genoma completo de estas cepas permitió la detección de ciertos marcadores específicos para ST175: serotipo O:4, PDC-1, OXA-50, CrpP-2, exoS, pilAI, pioverdina clase I, pérdida del sistema rhl; ST235: serotipo O:11, PDC-35, OXA-488, CrpP-1, exoU, pilAII, pioverdina clase II; y ST973: serotipo O:15, PDC-5, OXA-50, CrpP-4, exoS, pilAII, pioverdina clase III, pérdida de lasR. Todos los datos de P. aeruginosa aportados en esta tesis ponen de manifiesto la importancia de las cepas de orígenes diferentes al entorno clínico como posibles reservorios de determinantes de resistencia y virulencia, que deben considerarse y monitorizarse desde un enfoque “One Health”. Los resultados proporcionados podrían servir de base para estudios más específicos centrados en una mejor gestión de antibióticos y nuevos desarrollos terapéuticos.