Puesta a punto de un nuevo método de análisis instrumental por GC-MS y desarrollo de nuevas metodologías basadas en técnicas espectrales para la estimación de la composición aromática varietal de la uva

Abstract

La composición volátil de la uva es uno de los parámetros más importantes para determinar la calidad del mosto y del vino. Los aromas de la uva, también llamados primarios, se dividen en aromas varietales y prefermentativos. Estos compuestos se encuentran en muy bajas concentraciones en la uva, por lo que, para llevar a cabo su identificación y cuantificación, se requiere de un método eficaz de extracción para su posterior análisis cromatográfico. El análisis de compuestos volátiles de las uvas mediante métodos cromatográficos presenta numerosos inconvenientes, como el consumo de tiempo, la pérdida de muestra y preparación de la misma, los costes de reactivos e instrumentación y la necesidad de personal formado, por lo que estos equipos solo están disponibles en algunos centros de investigación y en grandes bodegas. Actualmente no existe ningún método que permita realizar análisis rutinarios a tiempo real de la composición aromática de las uvas a lo largo de su maduración, hecho que le permitiría al viticultor tomar decisiones respecto a las prácticas vitícolas, a la elección de la fecha de vendimia o a la clasificación de la uva en función de su calidad aromática. Este hecho ha cobrado mayor importancia en los últimos años debido al desequilibrio entre la madurez industrial (contenido de azúcares/ácidos) y las madureces fenólica y aromática en la uva, provocado por el efecto del cambio climático. Como consecuencia del mismo, las bayas alcanzan más rápidamente el contenido adecuado de azúcares (medidos como sólidos solubles totales (TSS, Total Soluble Solids) (ºBrix)), pero no de compuestos fenólicos y aromáticos (compuestos que se sintetizan más tarde en la baya). En los últimos años se han desarrollado métodos rápidos y no destructivos que permiten relacionar datos espectrales con la concentración de componentes químicos específicos (TSS, compuestos fenólicos, compuestos aromáticos, compuestos nitrogenados…). Dos de estas tecnologías son la espectroscopía de infrarrojo cercano (NIRS, Near-Infrared Spectroscopy) y la imagen hiperespectral (HSI, Hyperspectral Imaging). Ambas han sido utilizadas para estimar tanto parámetros generales en las uvas, como aminoácidos, o compuestos fenólicos. La NIRS se ha utilizado para medir la composición aromática en vinos, pero se ha utilizado muy poco para estimar la composición volátil de las bayas. En cuanto a la HSI, se ha utilizado para medir la composición aromática de otras matrices como café, huevos o carne de cerdo, pero, únicamente se ha encontrado un trabajo en el que haya sido utilizada para estimar la composición aromática de las uvas, y ninguno para monitorizar la misma a lo largo de su maduración. Por todos estos motivos, en la presente tesis doctoral se han desarrollado nuevas metodologías, basadas en técnicas espectrales, que permiten la estimación y monitorización de la composición aromática de la uva a lo largo de la maduración, de forma rápida y no invasiva. Para ello, en primer lugar, se optimizaron tres técnicas para la extracción de compuestos volátiles en mosto: extracción mediante barrita agitadora absorbente (SBSE, Stir Bar Sorptive Extraction), su variante multi-SBSE (mSBSE), en la que se utilizaron barritas agitadoras de polidimetilsiloxano (PDMS) y de etilenglicol (EG) de forma simultánea, y microextracción en fase sólida mediante película fina (TF-SPME, Thin Film – Solid Phase Microextraction), en la que se probaron las películas finas de PDMS/carboxen (PDMS/CAR) y de PDMS/divinilbenceno (PDMS/DVB). Los factores optimizados fueron el modo, velocidad, tiempo y temperatura de extracción, y la adición de NaCl. A su vez, se puso a punto el análisis de dichos compuestos por cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS, Gas Chromatography – Mass Spectrometry). Una vez optimizadas las tres técnicas, se eligió la que mejores resultados proporcionó, que fue TF-SPME-GC-MS, con la película fina de PDMS/CAR y bajo las condiciones de inmersión directa (DI), a 500 rpm, durante 6 horas a 20 ⁰C. Dicha técnica se utilizó posteriormente como método de referencia para la determinación de compuestos volátiles en las muestras de mosto. En segundo lugar, se tomaron medidas espectrales, en condiciones de laboratorio, de 240 muestras de Vitis vinifera L. Tempranillo y 240 de Tempranillo Blanco, recogidas durante los años 2019 y 2020, mediante HSI en el rango 400-1.000 nm y mediante NIRS en el rango 1.100 – 2.100 nm. En tercer lugar, se midieron los TSS y se analizaron los compuestos volátiles de esas mismas muestras con el método TF-SPME-GC-MS optimizado, se integraron los cromatogramas y se obtuvieron, de esta forma, los datos de referencia. Por último, se construyeron los modelos de calibración multivariante, mediante regresión por mínimos cuadrados parciales modificados (MPLS), utilizando los datos espectrales adquiridos y los datos de referencia. Los resultados obtenidos demostraron que las técnicas HSI y NIRS permiten diferenciar entre valores altos, medios y bajos de cada compuesto volátil, e incluso cuantificar la concentración de muchos de ellos, así como de los TSS, en la variedad Tempranillo Blanco a lo largo de su maduración. Por otro lado, los resultados obtenidos para la variedad Tempranillo demostraron que las técnicas espectrales HSI y NIRS permiten diferenciar entre valores altos y bajos, y en ocasiones diferenciar entre valores altos, medios y bajos de concentración de compuestos volátiles y TSS. En esta tesis doctoral se ha desarrollado, por primera vez, una herramienta que permite predecir la madurez tecnológica y la madurez aromática, simultáneamente, de forma rápida, sin contacto y no invasiva, a lo largo de la maduración de las bayas de Tempranillo Blanco y Tempranillo.