Diseño de inhibidores específicos de glicosidasas y su aplicación en terapias contra el cáncerefecto del aglicón y de la multivalencia en la afinidad de iminoazúcares sp2 frente a enzimas y lectinas

Resumen

El objetivo general de esta Tesis se centra en el diseño de ligandos selectivos de diferentes glicosidasas, que se encuentran involucradas en una serie de procesos patológicos. Entre las enzimas diana están las glicosidasas lisosomales, implicadas en enfermedades de almacenamiento lisosomal y las alfa-glucosidasas y alfa-manosidasas del retículo endoplasmático-aparato de Golgi, implicadas en el desarrollo del cancer. Los ligandos, de tipo iminoazúcares sp2, se han preparado siguiendo estrategias sintéticas dirigidas a introducir diversidad molecular con un coste sintético relativamente bajo. Los estudios estructura-actividad se han realizado de forma paralela a la síntesis, lo que ha facilitado la tarea de encontrar buenos candidatos a fármacos. - Preparación de pseudo O-, N-, S- y C- glicósidos de iminoazúcares sp2 bicíclicos y tricíclicos. 1. Generalized Anomeric Effect in gem-Diamines: Stereoselective Synthesis of alfa-N- Linked Disaccharide Mimics, Elena M. Sánchez-Fernández, Rocío Rísquez-Cuadro, Carmen Ortiz Mellet, José M. García Fernández, Org. Lett., 2009, 11, 3306-3309. La posibilidad de generar intermedios de tipo aciliminio en iminoazúcares sp2 bicíclicos permite llevar a cabo la adición de diferentes nucleófilos de oxígeno, azufre, nitrógeno o carbono en posición pseudoanomérica y acceder, de esta manera, a derivados con estructura de pseudo-O-, S-, N- o C- glicósido. El fuerte efecto anomérico en estos sistemas, unido a consideraciones estéricas, dirige la reacción total o mayoritariamente hacia el epímero ¿, con disposición axial del sustituyente pseudoglicosídico. Los compuestos resultantes tienen un perfil configuracional análogo al de los alfa-glicósidos naturales. - Actividad antitumoral de iminoazúcares sp2 inhibidores de la alfa-glucosidasa neutra. 2. Synthesis of N-, S-, and C-Glycoside castanospermine analogues with selective neutral alfa-glucosidase inhibitory activity as antitumor agents, Elena M. Sánchez-Fernández, Rocío Rísquez-Cuadro, Maud Chasseraud, Ahmed Ahidouch, Carmen Ortiz Mellet, Halima Ouadid-Ahidouch, José M. García Fernández, Chem. Commun., 2010, 46, 5328-5330. 3. Patente. Derivados sp2 iminoazúcar como inhibidores de las alfa-glucosidasas, Elena M. Sánchez-Fernandez, Rocío Rísquez-Cuadro, Carmen Ortiz Mellet, José M. García Fernández, N. de solicitud: ES/P201030867, 2010 ; N. de publicación: PCT/ES2370852, 2011. Entidad titular: CSIC-Universidad de Sevilla. La estrategia anterior se ha aplicado con éxito a la preparación de series de compuestos derivados de 5,6-oxometiliden-manojirimicina (OMJ) y -nojirimicina (ONJ). En el primer caso, sólo los N-glicósidos se comportaron como inhibidores selectivos de alfa-manosidasa, probablemente porque se necesita la activación del glicomimético mediante protonación para que produzca su unión al sitio activo de la enzima. Por su parte, todos los derivados pseudoglicosídicos de ONJ, incluidos los conjugados con uniones glicosídicas poliatómicas (urea, tiourea, amida) o incluso derivados tricíclicos, asimilables a pseudoglicósidos conformacionalmente restringidos, se comportaron como inhibidores selectivos de la alfa-glucosidasa neutra de levadura. Dado que esta enzima está estructuralmente relacionada con las alfa-glucosidasas I y II que intervienen en etapas decisivas de la biosíntesis de las N-glicoproteinas, en particular de las cadenas oligosacarídicas aberrantes presentes en células tumorales, estos datos son indicativos de una potencial actividad como agentes antitumorales. La evaluación de la actividad antiproliferativa de los derivados pseudo-N-, S- y C-octilglicosídicos de ONJ en la línea celular de cáncer de mama humano no invasiva MCF-7 indicó que los tres compuestos inhiben la proliferación celular con una baja toxicidad, siendo los derivados de S- y C-octilo los más activos. Los pseudos-S- y C-octilglicosídicos de ONJ inhibieron igualmente la proliferación celular en la línea invasiva de cáncer de mama MDA-MB-231. El análisis de proteínas implicadas en el ciclo de división celular confirma que ambos compuestos actúan inhibiendo la mitosis de las células tumorales, sin afectar a células sanas (línea celular MCF-10A) incluso a concentraciones elevadas. Para el C-octilglicósido se ha confirmado, además, que es capaz de inducir muerte celular programada (apoptosis) en las células con índices de crecimiento descontrolado, de manera específica, confirmando su interés para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, menos agresivas, contra el cáncer. - Influencia de las propiedades conformacionales en la actividad inhibitoria de pseudodisacáridos miméticos de isomaltosa y maltosa. 4. sp2-Iminosugar O-, S- and N-glycosides as conformational mimics of alfa-linked disaccharides: Implications for glycosidase inhibition, Elena M. Sánchez-Fernández, Rocío Rísquez-Cuadro, Carmen Ortiz Mellet, José M. García Fernández, Pedro Miguel Nieto, Jesús Angulo, Chem. Eur. J., 2012, 18, 8527-8539. La aproximación desarrollada para la síntesis de derivados pseudoglicosídicos de iminoazúcares sp2 se ha extendido a la preparación de pseudo-O-, S- y N-disacáridos análogos de maltosa e isomaltosa. El estudio de las propiedades conformacionales de estos pseudodisacáridos, mediante técnicas de RMN y computacionales, ha puesto de manifiesto la gran influencia que ejerce la naturaleza del átomo intersacarídico en la flexibilidad alrededor de la unión pseudoglicosídica. La evaluación de la actividad inhibidora de estos compuestos frente a las enzimas maltasa e isomaltasa demuestra que para alcanzar afinidades elevadas no basta con diseñar análogos estructurales de los sustratos naturales de las enzimas, subrayando la importancia de incluir en el diseño molecular los aspectos conformacionales. - Efecto inhibidor multivalente de conjugados fulereno-iminoazúcar sp2. El perfil de selectividad de los iminoazúcares sp2 hacia diferentes glicosidasas puede modularse también mediante la presentación multivalente del motivo responsable de la actividad inhibidora (inhitopo) sobre una plataforma multiantenada. El análisis de los valores de constante de inhibición para derivados dodecavalentes de ONJ y OMJ centrados sobre el fulereno C60 permite concluir que determinados pares de inhitopo/ enzima, por ejemplo ONJ/alfa-manosidasa, son más propensos a experimentar un efecto inhibidor multivalente. - Efectos multivalente y heterocluster de sistemas homogéneos y heterogéneos iminoazúcar sp2/carbohidrato-beta-ciclodextrina frente a glicosidasas y lectinas. Los resultados de inhibición frente a glicosidasas de sistemas multivalentes pueden correlacionarse con la información estructural disponible para el sitio activo de las enzimas y con la afinidad de cada una por el motivo monovalente. En general, un efecto inhibidor multivalente elevado se produce cuando la interacción monovalente es débil y el sitio activo de la enzima es fácilmente accesible y puede acomodar más de una unidad de inhitopo simultáneamente (efecto micro-quelato). Los resultados también apuntan a que, incluso en aquellos casos en que el sitio glicónico está poco accesible, un incremento en la afinidad asociado a la presentación multivalente es posible por interacciones de los inhitopos con el sitio aglicónico de la enzima. Los diferentes mecanismos susceptibles de operar son, además, sensibles a parámetros estructurales, como la distancia entre los motivos de reconocimiento/inhibición. La constatación del efecto inhibidor multivalente evidencia la analogía existente entre el reconocimiento de un determinado motivo (pseudo)sacarídico por una lectina o una enzima. De hecho, es posible modular la información almacenada por un glicomimético o un azúcar, mediante su presentación multivalente, no sólo frente a diferentes glicosidasas o diferentes lectinas, sino también entre glicosidasas y lectinas en un escenario multimodal. Este hecho se ha podido poner de manifiesto mediante el estudio de la afinidad de derivados multivalente de ONJ centrados en la beta-ciclodextrina frente a diferentes glicosidasas y frente la lectina de Arachis hypogea, específica de lactosa (PNA). Los resultados apuntan a que los carbohidratos desempeñan un papel mucho más amplio como portadores de información biológica del que hasta ahora se consideraba. El concepto de código extendido para los azúcares (extended sugar code) implica, por ejemplo, que un determinado motivo glucídico (glicotopo) no sólo puede ver aumentada su afinidad por una lectina complementaria al presentarse de manera multivalente, sino que en estas circunstancias puede activarse, además, el reconocimiento por parte de enzimas frente a las que el elemento monovalente no presentaba actividad inhibitoria. Además, estas relaciones dependen no sólo de la densidad del motivo de reconocimiento primario, sino que puede verse afectada de manera importante en ambientes heterogéneos y por factores estructurales. En la práctica, supone la necesidad de revisar el estado actual de conocimientos en lo que a interacciones multivalentes en glicobiología se refiere. - Chaperonas farmacológicas de tipo no-iminoazúcar para la enfermedad de Gaucher. 5. Conformationally-Locked N-Glycosides with Selective beta-Glucosidase Inhibitory Activity: Identification of a New Non-Iminosugar-Type Pharmacological Chaperone for Gaucher Disease, Javier Castilla, Rocío Rísquez, Deysi Cruz, Katsumi Higaki, Eiji Nanba, Kousaku Ohno, Yoshiyuki Suzuki, Yolanda Díaz, Carmen Ortiz Mellet, Jose M. García Fernandez, Sergio Castillon, J. Med. Chem., 2012, 55, 6857-6865. Los resultados de inhibición obtenidos con iminoazúcares sp2 frente a diferentes glicosidasas demuestran que las interacciones aglicónicas son esenciales para modular la afinidad y la selectividad de acción una vez que el motivo de reconocimiento glicónico se sitúa en el sitio activo. Con objeto de confirmar la importancia de estas interacciones en el diseño de nuevos inhibidores de glicosidasas, hemos estudiado una serie de compuestos bicíclicos en los que el anillo polihidroxilado no es un iminociclitol, sino una glucopiranosa fusionada con un anillo de 2-tio-1,3-oxazolina. La introducción de un sustituyente omega-hidroxyhexadecilo sobre el azufre condujo a un inhibidor potente y selectivo de la beta-glucocerebrosidasa lisosomal. La evaluación de la actividad como chaperona farmacológica en fibroblastos de Gaucher con la mutación N370S/N370S indicó un comportamiento análogo al del ambroxol, con un aumento en la actividad de la enzima mutante de 1.8 veces.