Detección, entornos genéticos, localización y expresión de genes adquiridos de resistencia a Quinolonas en Enterobacteriaceae stars

Resumen

El principal mecanismo de resistencia a quinolonas en Enterobacteriaceae es la modificación de las dianas debida a mutaciones en los genes cromosómicos gyrA y parC. En las últimas décadas se han descrito nuevos mecanismos de resistencia a quinolonas, habitualmente mediados por plásmidos, como son los codificados por los genes qnr, aac(6¿)-Ib-cr, qepA y oqxAB. En este trabajo nos referiremos a ellos como genes adquiridos de resistencia a quinolonas (GARQ). Se evaluó la presencia de los genes qnrA, qnrB, qnrS, aac(6¿)-Ib-cr y qepA en una colección de 282 cepas de diferentes géneros (E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca, E. aerogenes y C. freundii) productoras y no productoras de BLEEs, incluyéndose entre ellas 3 cepas implicadas en brotes epidémicos hospitalarios. Se detectaron GARQ en el 9% del total de las cepas analizadas (24/282; 11 E. coli, 9 K. pneumoniae, 1 K. oxytoca, 2 E. aerogenes y 1 C. freundii), correspondiendo al 13% de las cepas productoras de BLEEs (21/164) y al 3% de las no productoras (3/118). El gen aac(6¿)-Ib-cr fue el GARQ más frecuentemente detectado (92% de las cepas positivas), seguido de los genes qnr (38%), y en especial, el gen qnrS (29%). Los genes qnr fueron principalmente detectados en cepas del género Klebsiella y el gen qepA, exclusivamente en una cepa E. coli. Se realizó el tipado molecular de las cepas de E. coli y K. pneumoniae portadoras de GARQ. Las 11 cepas E. coli se agruparon en 8 patrones de PFGE y en 3 grupos filogenéticos: B2 (n=5), B1 (n=1) y D (n=5). Todas las cepas del filogrupo B2 correspondieron a la secuencia tipo ST131, la del filogrupo B1 a la ST224 y las del filogrupo D a la ST648, excepto una de ellas que pertenecía a la ST205. Las 9 cepas K. pneumoniae se agruparon en 5 patrones de PFGE (2 cepas fueron no tipables por PFGE), pertenecían al grupo filogenético KpI, y correspondieron a distintas secuencias tipo: ST433 (n=5), ST341 (n=1), ST152 (n=1), ST15 (n=1) y ST431 (n=1). Las ST341, ST431 y ST433, descritas por primera vez en este trabajo, se incluyeron en la base de datos de K. pneumoniae del Instituto Pasteur. Se analizó el entorno genético de los GARQ y su localización en plásmidos o en el cromosoma bacteriano. Se detectaron 16 estructuras genéticas en las que se localizaban los GARQ, 12 de las cuales se describen por primera vez en este trabajo y fueron incluidas en la base de datos GenBank. Cabe destacar la presencia en dichas estructuras de elementos de adquisición y diseminación genética como integrones de clase 1, las secuencias de inserción IS26, IS6100 e ISCR1 o los transposones Tn1721 y Tn3. Aunque en la mayoría de los casos los GARQ se localizaron en plásmidos, en 3 cepas E. coli, 3 K. pneumoniae y 1 K. oxytoca, el gen aac(6¿)-Ib-cr se detectó por primera vez en el cromosoma, presentando también alguna de estas cepas una copia adicional del gen en plásmidos. Los plásmidos portadores de GARQ pertenecieron principalmente al grupo de incompatibilidad IncR en las cepas de Klebsiella, e IncF e IncN en las cepas de E. coli y C. freundii. No obstante, algunos plásmidos de las cepas de Klebsiella, E. coli y E. aerogenes fueron no tipables. En las cepas portadoras de GARQ se estudió también la presencia de otros mecanismos de resistencia asociados, así como la transferencia de los GARQ. Todas ellas presentaron un fenotipo de multirresistencia y múltiples mecanismos de resistencia. Todas las cepas E. coli y E. aerogenes presentaron mutaciones en las proteínas GyrA y ParC, sin embargo, en Klebsiella y Citrobacter, este mecanismo fue menos frecuente. El 71% de las cepas portadoras de GARQ presentaron integrones y se detectaron 2 nuevos integrones de clase 1 que fueron registrados en GenBank. Uno de ellos presenta 3 genes cassette codificantes de nuevas variantes de genes de resistencia (aac(6¿)-Ib23, catB3b y blaOXA-224) que se describen por primera vez en este trabajo. Se observó también la presencia de otros genes de resistencia que pudieron ser transferidos en todos los casos junto a los GARQ, como los genes blaCTX-M-15 (88% de las cepas), blaOXA-1 (92% de las cepas), tet(A) (especialmente en las cepas E. coli) y aac(3)-II y aph(3¿)-Ia (especialmente en las cepas K. pneumoniae). Se analizó la variación en los valores de CMI de quinolonas y aminoglucósidos y su relación con la adquisición de GARQ, observándose mayores incrementos en los casos en que se captaban varios GARQ y, especialmente, la asociación de los genes aac(6¿)-Ib-cr y qnrB. Finalmente, se evaluó la relación entre la expresión del gen aac(6¿)-Ib-cr con el nivel de resistencia conferido. Para ello, se analizó el nivel de expresión de dicho gen en 12 cepas E. coli, Klebsiella y E. aerogenes seleccionadas por presentar diferente número de copias del gen aac(6¿)-Ib-cr y distintos entornos genéticos del mismo. En las 2 cepas de E. aerogenes con un 88% de similitud por PFGE e igual número de copias del gen aac(6¿)-Ib-cr, se observó una clara relación entre el nivel de expresión y de resistencia: la expresión del gen aac(6¿)-Ib-cr fue 365 veces superior en la cepa con mayores valores de CMI de ciprofloxacino, norfloxacino, tobramicina y amikacina. Esta diferencia observada podría ser debida a la presencia, en la cepa más sensible, de una delección de 12pb que afectaba a la posible secuencia promotora del gen.