Detección y bases genéticas de beta-lactamasas AmpC y carbapenemasas en aislados clínicos y comensales de enterobacterias stars

Resumen

Las enterobacterias son patógenos oportunistas que habitualmente se encuentran en la microbiota intestinal humana y de otros mamíferos. Algunas especies de enterobacterias poseen genes codificantes de beta-lactamasas AmpC de manera intrínseca en su cromosoma y determinadas mutaciones en dichos genes puede provocar el aumento de su espectro de acción. Por otra parte, las enterobacterias son capaces de adquirir mecanismos de resistencia a diferentes familias de antibióticos. En los últimos años ha aumentado la preocupación por la diseminación de genes codificantes de carbapenemasas debido a la dificultad en el tratamiento de infecciones por bacterias que los portan. En esta tesis se ha llevado a cabo la detección y caracterización de genes de beta-lactamasas AmpC y de carbapenemasas en enterobacterias, así como el desarrollo de nuevos métodos que permitan su detección. El primer objetivo fue aislar y caracterizar enterobacterias de muestras fecales de individuos sanos. Se obtuvieron 70 aislados en los que se analizó el fenotipo de resistencia y la presencia de fenotipo AmpC y beta-lactamasa de espectro extendido (BLEE). Se detectó un 57% de aislados resistentes a ampicilina, 22 con fenotipo AmpC y 3 con fenotipo BLEE. De los 22 aislados con fenotipo AmpC, se detectó el gen cromosómico ampC especie-específico en 21 aislados (13 Citrobacter freundii complex, 8 Enterobacter cloacae) y al menos dos copias del gen blaCMY-2 localizado en un plásmido conjugativo IncK de 78 Kb, en un aislado de Escherichia coli ST405. La prevalencia de aislados portadores de genes ampC plasmídicos fue del 1,4 %. El segundo objetivo fue la caracterización de enterobacterias de origen clínico. Se estudiaron 81 aislados sospechosos de portar beta-lactamasa AmpC o pertenecientes a especies poseedoras de cAmpC. En 57 de estos aislados se detectaron genes ampC, 8 de ellos de localización plasmídica (E. coli, Citrobacter, Proteus y Klebsiella) y los 49 restantes de localización cromosómica (24 Citrobacter, 16 Enterobacter, 7 Morganella y 2 Proteus). En todos los aislados de ambos orígenes se estudió la presencia de otros genes de resistencia. Los aislados de muestras fecales de individuos sanos con fenotipo BLEE portaban blaSHV-12 (2 aislados) y blaCTX-M-15+blaOXA-1 (1). Se detectó una amplia variedad de genes de resistencia a betalactámicos, así como la presencia de genes de resistencia a aminoglucósidos, sulfamidas, cloranfenicol, tetraciclinas, rifampicina y quinolonas. Se caracterizaron 20 integrones de clase 1 con gran diversidad en sus estructuras y 3 integrones de clase 2. El tercer objetivo fue analizar el polimorfismo de los genes ampC y qnrB cromosómicos de los géneros Citrobacter, Enterobacter y Morganella; así como estudiar su diversidad clonal en los aislados de ambos orígenes. Se detectó un alto grado de polimorfismo de los genes ampC, así como del gen ampR y de las regiones intergénicas ampR/ampC. Se obtuvo un total de 29 variantes de CMY; 15 de ACT, 4 de DHA y 2 de MIR. Entre las variantes detectadas, 43 no habían sido descritas anteriormente, por lo que se incluyeron en GenBank y www.lahey.org/Studies. Los aislados de estos géneros no sólo mostraron una alta variedad en estos genes sino que también mostraron una alta diversidad clonal entre ellos. Además, se detectaron 12 variantes del gen qnrB entre los 18 aislados de Citrobacter qnrB-positivos (5/13 de muestras fecales/clínicas, respectivamente). La variante qnrB50 ha sido descrita por primera vez . El cuarto objetivo planteado fue la caracterización bioquímica de una beta-lactamasa ESAC, así como el estudio del efecto del avibactam en aislados con este fenotipo. El estudio realizado determinó que la deleción Asn289 era la responsable de la generación del fenotipo ESAC, que a su vez no afectó la inhibición de la beta-lactamasa por avibactam. Las alteraciones en la secuencia aminoacídica de las beta-lactamasas ESAC estudiadas no modificaron la acción del inhibidor avibactam. El quinto objetivo planteado fue la caracterización de los mecanismos de resistencia a carbapenémicos. En este estudio destacan la caracterización completa de los aislados, portadores de beta-lactamasas de interés, procedentes de dos casos clínicos. El primer caso clínico se debía a la infección por un aislado de E. coli ST448/B1 multirresistente que presentó 6 genes codificantes de beta-lactamasas (blaVIM-1, blaKPC-3, blaSHV-12, blaOXA-9, blaTEM-1a y blaCMY-2) así como otros 11 genes de resistencia a distintos antibióticos, y el gen de virulencia fimA. En este aislado se detectó un integrón de clase 1 que no había sido descrito previamente (In916). El segundo caso se trataba de una coinfección por C. freundii y P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos. Ambos aislados poseían el gen blaVIM-2 en integrones de clase 1 con diferentes estructuras y promotores. Este estudio es la primera descripción de C. freundii portador de blaVIM-2 en nuestro país. Finalmente, el sexto objetivo planteado fue la generación de un protocolo de detección fenotípica de carbapenemasas. En este estudio se propone un nuevo algoritmo para la detección fenotípica de carbapenemasas. En este algoritmo se incluyen dos métodos fenotípicos nuevos basados en el uso de inhibidores y permite la diferenciación de los distintos tipos de carbapenemasas, incluyendo OXA-48.