Desarrollo de cepas vínicas de Saccharomyces cerevisiae superproductoras de manoproteinas mediante tecnicas de DNA recombinante, y su aplicación en enologia

Resumen

ÍNDICE DE CONTENIDOS I ÍNDICE DE FIGURAS VII ÍNDICE DE TABLAS XIII ABREVIATURAS XV ÍNDICE DE CONTENIDOS INTRODUCCIÓN 1. Características generales de las levaduras 3 2. La pared celular de las levaduras 4 2.1. Estructura y síntesis de la pared celular. 5 2.1.1. p-1,3-glucano 6 2.1.2. Quitina 8 2.1.3. p-1,6-glucano 10 2.1.4. Manoproteínas 12 2.2. Regulación de la composición y estructura de la pared celular 18 2.2.1. Factores ambientales y del crecimiento 18 2.2.2. Condiciones de estrés 19 2.3. Mutantes de deleción en genes implicados en la síntesis o remodelación de la pared 23 2.3.1. Genes implicados en la síntesis del p-l,3-glucano 24 2.3.2. Genes implicados en la regulación de la síntesis de la pared 25 2.3.3. Genes implicados en la síntesis del anclaje GPI 26 2.3.4. Otros genes 27 3. Elaboración del vino 28 4. Propiedades enológicas de las manoproteínas 30 4.1. Protección frente a la quiebra proteica 31 4.2. Protección frente a la precipitación tartárica 37 4.3. Otras propiedades 38 4.3.1. Adsorción de Ocratoxina A 38 4.3.2. Retención de substancias aromáticas 38 4.3.3. Disminución de la astringencia «38 4.3.4. Estabilización del color 39 índice 4.3.5. Estimulación del crecimiento de las bacterias lácticas 39 4.3.6. Estabilización de la espuma en vinos espumosos 39 4.4. Enriquecimiento del vino en manoproteínas 40 5. Aplicación de la ingeniería genética a la mejora de las levaduras vínicas 41 5.1. Consideraciones generales 41 5.1.1. Sistemas de transformación 42 5.1.2. Vectores para la clonación de genes 43 5.1.3. Marcadores de selección 44 5.2. Especificidades de las levaduras vínicas 44 5.3. Ejemplos de aplicaciones de mejora genética de levaduras vínicas mediante ingeniería genética 47 OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 51 MATERIALES Y MÉTODOS 55 1. Cepas 57 1.1. Cepas de Escherichia coli 57 1.2. Cepas de Saccharomyces cerevisiae 57 1.2.1. Cepas haploides de laboratorio 57 1.2.2. Cepas diploides de laboratorio 58 1.2.3. Cepas vínicas 59 1.3. Otras cepas de levadura 59 2. Medios de cultivo 60 2.1. Medios de cultivo de levaduras 60 2.2. Medios de cultivo de bacterias 62 3. Soluciones 62 4. Cebadores 63 5. Vectores 65 6. Manipulación y análisis de ácidos nucleicos 65 6.1. Aislamiento de DNA genómico de S. cerevisiae 65 6.2. Aislamiento de DNA plasmídico de E. coli 66 6.3. Electroforesis de DNA en geles de agarosa 66 6.4. Digestión de DNA 67 II Índice 6.5. Ligación de fragmentos de DNA 67 6.6. Amplificación de fragmentos de DNA mediante PCR 67 6.7. Clonación de secuencias en plásmidos mediante la técnica descrita por Geiser et al. (2001) 68 6.8. Consfrucción de cassettes de deleción 69 7. Métodos de transformación de microorganismos 75 7.1. Transformación genética de E. coli por electroporación 75 7.2. Transformación genética de 5. cerevisiae 76 8. Deleción de genes en cepas vínicas de S. cerevisiae 77 8.1. Transformación 77 8.2. Análisis de los transformantes 77 9. Medida de la liberación de polisacáridos 79 9.1. Condiciones de cultivo 79 9.2. Aislamiento de la fracción macromolecular presente en los sobrenadantes. ...79 9.3. Cuantificación de polisacáridos totales. Método del fenol/sulfiírico 80 10. Detección de manoproteínas 81 10.1. Electroforesis de proteínas en SDS-PAGE 81 10.2. Electrotransferencia 81 10.3. Hibridación con Concanavalina-A marcada con Peroxidasa 82 11. Estudios de fermentación y de estabilidad proteica 82 11.1. Fermentación de mostos sintéticos y naturales 82 11.2. Determinación del poder fermentativo. Cuantificación de azúcares, etanol y glicerol en vino mediante HPLC 83 11.3. Medida de la estabilidad proteica vinos Sauvignon blanc 83 11.4. Determinación de la concentración mínima de bentonita para la estabilización proteica de vinos Sauvignon blanc 83 12. Determinación de resistencia a la toxina K9 84 13. Determinación de fenotipo autolítico 84 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 87 1. Medida de la liberación de polisacáridos y manoproteínas en cepas de laboratorio 89 1.1. Puesta a punto del ensayo de liberación de polisacáridos y manoproteínas en condiciones de laboratorio 89 IH índice 1.2. Liberación de polisacáridos y manoproteínas por cepas haploides de laboratorio 91 1.2.1. Cepas con fondo genético BY4741 91 1.2.2. Cepas con fondo genético FY1679-08A 93 1.2.3. Otros fondos genéticos 95 1.3. Liberación de polisacáridos y manoproteínas por cepas diploides de laboratorio 97 1.3.1. Cepas heterozigotas 98 1.3.2. Cepas homozigotas 99 1.4. Estudio de la estabilización proteica de las manoproteínas y polisacáridos liberados por cepas de laboratorio 101 1.5. Discusión de los datos obtenidos con cepas de laboratorio 104 2. Construcción de cepas de levaduras vínicas delecionadas en los genes KNR4, GPI7, FKSl y GASl 106 2.1. Construcción de cepas delecionadas en KNR4 107 2.2. Construcción de cepas delecionadas en GPI7 109 2.3. Construcción de cepas delecionadas en FKSJ 111 2.4. Construcción de cepas delecionadas en GASl 113 2.5. Discusión de la deleción de genes en cepas industriales 114 3. Caracterización de cepas industriales delecionadas en los genes KNR4, GPI7, FKSl y GASl 117 3.1. Estudio de la liberación de manoproteínas y polisacáridos en condiciones de laboratorio 117 3.2. Determinación de la capacidad autolítica 119 3.3. Determinación de la resistencia a la toxina K9 120 3.4. Estudio de la capacidad fermentativa de mostos naturales 122 3.4.1. Cepas delecionadas en KNR4 124 3.4.2. Cepas delecionadas enGPI? 127 3.4.3. Cepas delecionadas en FKSl 130 3.4.4. Cepas delecionadas en GASl 131 3.4.5. Discusión de los resultados 134 3.5. Estabilidad proteica de los vinos naturales fermentados 136 3.5.1. Cepas delecionadas en KNR4 136 IV índice 3.5.2. Cepas delecionadas en GPI7 139 3.5.3. Cepas delecionadas en FKSl 141 3.5.4. Cepas delecionadas en GASl 142 3.5.5. Discusión de los resultados 143 3.6. Determinación de la dosis mínima de bentonita necesaria para la estabilización de vinos naturales fermentados 144 3.6.1. Cepas delecionadas en KNR4 144 3.6.1.l.EKD-13 144 3.6.1.2.TKI>124 148 3.6.2. Cepas delecionadas en GPI7 151 3.6.2.1 .EGD-13 151 3.6.2.2.TGD^13 153 3.6.3. Cepas delecionadas en FKSl: EFD-31 154 3.6.4. Cepas delecionadas en GASl: TGASD-13 156