Desarrollo de métodos rápidos de análisis basados en espectrometría de masas con ionización por electrospray para la determinación de compuestos de interés clínico en matrices biológicas
- Fernández del Campo García, María Teresa
- Encarnación Rodríguez Gonzalo Director/a
- Ana María Casas Ferreira Codirector/a
Universitat de defensa: Universidad de Salamanca
Fecha de defensa: 02 de de setembre de 2022
- María Teresa Tena Vázquez de la Torre Presidenta
- Carmelo García Pinto Secretari/ària
- Alegría Carrasco-Pancorbo Vocal
Tipus: Tesi
Resum
El objetivo general de esta Tesis Doctoral es la puesta a punto de metodologías analíticas rápidas basadas en espectrometría de masas con una fuente de ionización por electrospray orientadas a la determinación y cuantificación de compuestos de interés clínico en muestras biológicas no invasivas. Esta tesis se presenta en la modalidad por compendio de publicaciones, y los diferentes artículos publicados a partir del trabajo realizado se han dividido en dos capítulos generales en función de las metodologías rápidas desarrolladas. - En el capítulo I se desarrolla una metodología que permite realizar, utilizando la misma configuración instrumental, un análisis rápido para el cribado de muestras y un análisis de confirmación de resultados, en caso de ser necesario. Esta metodología se ha aplicado a la determinación de poliaminas y aminoácidos sin derivatizar en muestras de saliva. En este capítulo se incluye un trabajo de investigación en el cual se propone una estrategia basada en la introducción directa de la muestra en el espectrómetro de masas, como etapa de cribado, con la posibilidad de llevar a cabo, en la misma configuración instrumental, el análisis confirmatorio utilizando una técnica de separación. Para ello, se utiliza un cromatógrafo de líquidos acoplado a un espectrómetro de masas donde se mantiene la columna cromatográfica en el sistema. La utilización de una fase móvil con un alto poder de elución elimina la capacidad separativa de la columna, permitiendo la introducción directa de la muestra en el equipo de espectrometría de masas. Con un cambio en la composición de la fase móvil es posible la separación cromatográfica de los compuestos. La metodología propuesta es aplicada a la determinación de un grupo de compuestos endógenos polares de distinta naturaleza (creatinina, poliaminas y aminoácidos) en muestras de saliva. Los resultados cuantitativos obtenidos en las etapas de cribado y confirmación están en buena concordancia, lo que demuestra la validez de la estrategia propuesta. -El capítulo II se centra en el desarrollo de metodologías rápidas basadas en el uso de precolumnas de protección acopladas directamente al espectrómetro de masas. La precolumna de protección actúa como etapa de limpieza y fraccionamiento de baja resolución previa a la introducción de la muestra en el espectrómetro de masas. Este capítulo II consta de tres trabajos de investigación. En los dos primeros se utiliza un espectrómetro de masas con un analizador de triple cuadrupolo para la determinación de compuestos endógenos polares (poliaminas compuestos relacionados) y aminoácidos sin derivatizar en muestras de orina. El tercer trabajo se centra en la determinación de aminoácidos en orina, utilizando un espectrómetro de masas con un analizador de masas Orbitrap. En los trabajos incluidos en este capítulo II, con objeto de confirmar los resultados obtenidos con los métodos rápidos desarrollados, también se desarrollan métodos basados en cromatografía líquida-espectrometría de masas adecuados para cada grupo de compuestos. En el primer trabajo incluido en este capítulo se desarrolla un método basados en el acoplamiento de una precolumna de protección a espectrometría de masas en tándem (gC-FIA-MS/MS) para la determinación de poliaminas y compuestos relacionados en muestras de orina. La incorporación de la precolumna de protección previa a la introducción de la muestra en el espectrómetro de masas proporciona una notable mejora de la sensibilidad y de la morfología de la señal respecto a los resultados obtenidos cuando la muestra se introduce directamente sin separación en el espectrómetro de masas, sin incrementar significativamente el tiempo de análisis. Además, incorpora una etapa de limpieza de la fracción más polar de la matriz. La comparación de los resultados cuantitativos obtenidos con la configuración gC-FIA-MS/MS con los obtenidos mediante un sistema cromatográfico proporciona resultados satisfactorios para la mayoría de los compuestos en estudio. Estos resultados ponen de manifiesto que la estrategia gC-FIA-MS/MS desarrollada podría usarse como metodología rápida para un cribado inicial de las muestras, las cuales solo serían analizadas por el método cromatográfico de confirmación (LC-MS/MS) si mostraran valores anómalos de los compuestos de interés. En el segundo trabajo incluido en este capítulo se lleva a cabo el desarrollo y la validación de un método rápido y fiable de análisis basado en el acoplamiento de una precolumna de protección a un espectrómetro de masas gC-MS/MS para la determinación de aminoácidos proteinogénicos en orina. El tratamiento de muestra utilizado es simple, sin necesidad de utilizar reacciones de derivatización. Para confirmar los resultados obtenidos, también se desarrolla un método de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS). La precolumna de protección permite obtener mejores morfologías de pico, así como una mayor sensibilidad en comparación con los resultados obtenidos cuando la muestra se introduce directamente en el espectrómetro de masas. Todas estas mejoras se consiguen sin un aumento significativo en el tiempo de análisis. Además, permite resolver algunos de los problemas relacionados con compuestos isobáricos. Los resultados obtenidos en la etapa de validación son altamente satisfactorios. Se analizan las muestras de orina de 18 sujetos aparentemente sanos, evaluándose la posible diferencia en la concentración de aminoácidos entre hombres y mujeres. No se observan diferencias significativas entre grupos. La concordancia entre los resultados obtenidos mediante LC-MS/MS y gC-MS/MS demuestran que esta última es una estrategia rápida adecuada para la determinación de aminoácidos en orina. En comparación con otros métodos que aparecen en bibliografía, la metodología desarrollada presenta importantes ventajas, como son la simplicidad en el tratamiento de la muestra, sin la necesidad de derivatizar los compuestos, la utilización de instrumentación convencional y la reducción de los tiempos de análisis comparados con los métodos separativos ya propuestos. El tercer trabajo de investigación incluido en este capítulo II se centra en el desarrollo de una nueva metodología basada en el acoplamiento de una precolumna de protección convencional a un analizador de masas Orbitrap (gC-Orbitrap-HRMS) para la detección y cuantificación de aminoácidos proteinogénicos en orina. El tratamiento aplicado a las muestras es sencillo implicando la mínima manipulación de las mismas. Se evalúan distintas precolumnas de protección y los mejores resultados se obtienen con la precolumna de protección tipo HILIC. Esta precolumna proporciona una mejor separación de los compuestos en el menor tiempo de análisis, las señales analíticas más altas y la mejor morfología de pico. Los LODs y LOQs obtenidos con esta estrategia son satisfactorios y adecuados para la concentración de aminoácidos presentes en la orina. El método desarrollado se aplica satisfactoriamente al análisis de muestras de orina de voluntarios sanos, utilizándose un protocolo de adición estándar de un punto y normalización con patrón interno (marcado isotópicamente) debido a la existencia de efecto de matriz. Los resultados obtenidos muestran que la metodología gC-Orbitrap-HRMS propuesta es una opción rápida y fiable para la determinación de los aminoácidos en orina. El tiempo total del análisis es de 1.6 min, muy inferior a los tiempos necesarios para las técnicas cromatográficas habitualmente utilizadas para estos compuestos en orina. Además, la alta resolución del analizador de masas Orbitrap permite realizar un análisis con gran selectividad.