Biocontrol de podredumbres en frutas por bacillus amyloliquefaciens buz-14

Resumen

El sector hortofrutícola es uno de los más importantes en España, siendo una de las principales fuentes de ingresos para el país gracias a las exportaciones a Europa y al resto del mundo. La importancia de este sector hace que deba ser tratado con especial cuidado, evitando en todo momento que las plagas se conviertan en un problema significativo con las consecuentes pérdidas económicas y productivas para los agricultores. Las principales pérdidas suelen ir asociadas a podredumbres, ocasionadas por microorganismos fitopatógenos. El control de éstos se ha conseguido durante muchos años mediante el uso de pesticidas de síntesis química, sustancias activas con un elevado potencial antimicrobiano. Sin embargo, la aparición de resistencias ha hecho que las aplicaciones aumentaran exponencialmente y de manera descontrolada, por lo que actualmente las dosis utilizadas son mucho mayores que hace unas décadas. La contaminación ambiental y los riesgos para el ser humano hace que la presión social sea cada vez mayor, obligando a las Administraciones de cada Estado Miembro a tomar medidas alternativas. Una de ellas es el control biológico o biocontrol, estrategia que utiliza microorganismos antagonistas que inhiben el crecimiento de otros indeseables, ya sea mediante la producción de antibióticos, hiperparasitismo, competición por espacio y nutrientes o incluso induciendo resistencias sistémicas en las propias plantas. En esta Tesis Doctoral se ha investigado el potencial de biocontrol que tiene la cepa bacteriana Bacillus amyloliquefaciens BUZ-14, inicialmente aislada de melocotones y cuya caracterización como agente de biocontrol ha sido llevada a cabo. Para ello se han investigado los mohos fitopatógenos frente a las que es activo, incluyendo Botrytis cinerea, Penicillium spp. y Monilinia spp., elucidando su modo de acción y finalmente siendo escalado industrialmente para poder ser aplicado tanto en pre- como en postcosecha. En primer lugar, se llevó a cabo la identificación molecular del agente de biocontrol, seguido de una caracterización física y biológica. A continuación, se determinaron las condiciones de crecimiento, incluyendo temperatura y pH, y se evaluó la capacidad antagonista de la cepa in vitro e in vivo. Posteriormente se estableció tanta la actividad antifúngica de las células como de los metabolitos presentes en el sobrenadante para poder elucidar posteriormente el modo de acción, identificar y cuantificar los lipopéptidos presentes en el medio y estudiar los compuestos más activos. Una investigación similar se llevó a cabo con los compuestos orgánicos volátiles (COVs), determinando la actividad in vitro e in vivo del volatoloma y de los volátiles más activos individualmente. La formulación del agente fue testada de tres maneras diferentes: líquida, desecada y liofilizada. La formulación líquida se desarrolló con ingredientes baratos que permitieran su posterior escalado industrial, a partir del cual se elaboraron los medios deshidratados. Se evaluó su estabilidad y eficacia durante un año de almacenamiento a temperatura ambiente y de refrigeración. Finalmente, el formulado líquido fue aplicado en viñedos, comprobando la compatibilidad del agente con los pesticidas usados en campo y evaluando su eficacia frente a B. cinerea en variedades como Garnacha y Syrah. En postcosecha el formulado fue aplicado mediante inmersión en nectarinas y se determinó su eficacia frente a Monilinia spp. Los árboles filogenéticos evidenciaron su cercanía a la especie B. amyloliqueafaciens subsp. plantarum, conocida por su capacidad de promover el crecimiento y desarrollo de las plantas. Los resultados mostraron la gran aptitud de la cepa B. amyloliquefaciens BUZ-14 para poder ser desarrollado como agente comercial de biocontrol, principalmente frente a Monilinia spp. en frutas de hueso. La producción de endosporos favoreció las formulaciones deshidratadas, así como la viabilidad en el campo y en la superficie de las frutas durante un prolongado periodo de tiempo. BUZ-14 fue capaz de controlar de manera preventiva P. italicum y P. digitatum en cítricos y P. expansum en manzanas, mientras que un tratamiento curativo fue suficiente para poder evitar la infección por Monilinia spp. en fruta de hueso. El principal modo de acción demostrado ha sido la antibiosis, mediante la producción de compuestos como los lipopéptidos o los volátiles. La iturina A ha resultado ser el principal lipopéptido responsable de las inhibiciones frente a la mayoría de las enfermedades testadas. Además, se ha observado como BUZ-14 es capaz de producir iturina A en el propio melocotón mientras prolifera en el interior del fruto. El volatoloma de BUZ-14 también resultó ser eficaz frente a las enfermedades estudiadas, siendo el diacetilo, el benzaldehído y el alcohol isoamílico los más activos. Los tres compuestos controlaron la podredumbre gris en uva de mesa a concentraciones muy bajas (0,02, 0,05, 0,1 L mL-1 respectivamente) sin causar fitotoxicidad, mientras que solo el alcohol isoamílico a concentración de 0,02 L mL-1 pudo controlar M. laxa en albaricoque. Todos mantuvieron la estabilidad y eficacia durante un año almacenados a temperatura ambiente y refrigeración, excepto el líquido a temperatura ambiente, aunque una buena gestión experimental podría evitar este problema de contaminación. En campo, el agente de biocontrol fue compatible con casi todos los pesticidas usados habitualmente en los tratamientos. Una vez aplicado el bioformulado en viñedos mediante pulverización durante una campaña, se obtuvo una reducción del 50 % en la incidencia y severidad de B. cinerea. Por otro lado, un resultado similar se obtuvo en las nectarinas bañadas en el bioformulado líquido, ya que se observó una reducción del 45 % en la incidencia de Monilinia spp. El desarrollo comercial de un producto basado en BUZ-14 como agente activo podría ser una alternativa para combatir principalmente la podredumbre marrón en fruta de hueso; además, más estudios centrados en su modo de acción y aplicación en diferentes frutos se están llevando actualmente a cabo para aumentar el conocimiento sobre las interacciones microbianas en cultivos frutales.