Estudio del reconocimiento del antígeno tn por anticuerpos/lectinas para el desarrollo de vacunas y nuevas herramientas de diagnóstico frente al cáncer

Resumen

Los resultados que se muestran en esta tesis doctoral recogen el estudio de las bases moleculares de la interacción que se produce entre el la lectina SBA, que reconoce el azúcar GalNAc selectivamente, y también con el anticuerpo 1SM3, que reconoce la secuencia APDT*RP, glicosilada en treonina, de MUC1. Un primer artículo recoge la interacción de la lectina SBA con el glicopéptido del antígeno Tn. El objetivo de este artículo pretende elucidar las bases moleculares de la interacción lectina-glicopéptidos del tipo Tn, derivados del esqueleto aminoacídico de MUC1. Este artículo se publicó en 2014, en la revista ACS CHEMICAL BIOLOGY (DOI: 10.1021/cb500855x). El primer paso de este artículo consistió en la purificación de la lectina SBA, para posteriormente poder realizar una serie de ensayos de afinidad con distintos glicopéptidos y obtener su estructura cristalina para analizar su interacción. Se recibió la lectina SBA liofilizada comercial, pero fue necesario un paso de purificación por una columna de exclusión molecular para evitarnos los posibles agregados que hayan podido surgir al rehidratarla. De este modo conseguimos obtener la lectina en solución para su uso en los ensayos posteriores. Todos los glicopéptidos que se muestran en esta tesis, han sido sintetizados en la Universidad de la Rioja por el grupo de Francisco Corzana. Para los ensayos de afinidad, dinámica molecular, RMN y cristalización se utilizaron una versión de glicopéptidos cortos. También se utilizaron unos derivados más largos, compuestos por la secuencia completa de MUC1 y glicosilados cada uno en una treonina distinta de las secciones del péptido, que se sintetizaron para estudiar como afectaban el resto de aminoácidos en el reconocimiento. Los ensayos de calorimetría de titulación isoterma (ITC), muestran como el glicopéptido 4 (APDT*R) presenta una mayor afinidad, frente a una baja afinidad por el glicopéptido 5 (APGST*AP) y prácticamente nula con el glicopéptido 3 (AHGVT*SA) por el cálculo de la constante de disociación. Se obtuvieron los mismos resultados de afinidad obtenidos por ensayos ELLA. En cuanto a sus parámetros termodinámicos de unión, los dos glicopéptidos que se pudo calcular sus Kds están favorecidos entálpicamente. Tras obtener estos resultados, se planteó la duda de si un glicopéptido más largo podría afectar a las interacciones en solución, en complejo con la lectina. Para resolverla se utilizaron los antes mencionados derivados más largos. Los resultados que se obtuvieron con los péptidos largos fueron equivalentes a los obtenidos con los péptidos cortos. Solo se obtuvo la estructura cristalina de la lectina SBA con el glicopéptido 4. Por rayos X presentaba dos modos de unión diferentes, también observadas en solución (DM y RMN). La densidad electrónica de la alanina no se observa en ninguna estructura, lo que sugiere que queda expuesto al solvente y posee una gran flexibilidad frente al resto de interacciones con lectina. Los modos de unión A y B difieren en la geometría del enlace glucosídico (asociado a Thr4), en A Thr4 adopta una conformación plegada y extendida en B. Si analizamos la superficie de potencial electrostático de la lectina, se puede observar como el glicopéptido 4 se posiciona en su superficie, interaccionando el azúcar y la cadena lateral del aminoácido de la arginina con dos zonas de potencial electrostático negativo de la lectina. A nivel de interacción entre aminoácidos podemos ver como se forman algunos puentes de H representados con flechas verdes y rojas. En el modo de unión A, se observa como los OH de GalNAc interaccionan con la lectina. El O3 forma puentes de H con Asp88 y Asn130, O4 también forma puente de H con Asp88 y con Leu214. El grupo carbonilo del N-acetilo de GalNAc interacciona con el amino (NH) de Gly106. Este enlace explica porque SBA une con gran afinidad a GalNAc frente a Galactosa. También se forma una interacción CH-pi entre la cara alfa del azúcar y Phe128. El grupo metilo de Thr4 también está involucrado con Phe128. Esta interacción puede ser responsable de la gran afinidad de SBA hacia el antígeno Tn cuando el aminoácido implicado es una treonina. Además de las interacciones que se formaban con el azúcar, se observó que la Arg5 participa en un puente iónico con Glu113 y un puente de H con el OH de Tyr107. Asp3 forma un puente de H con las cadenas laterales de Asn130 y Ser 131. En el modo de unión B, la interacción del glicopéptido con Ser 131 y Tyr107 son prácticamente nulas. En ambos modelos, Asp3 participa en un pte H con el grupo NH de GalNAc y otro con Thr4. Para demostrar la importancia de ambos aminoácidos en la unión a la lectina, se diseñó un glicopéptido 4 sustituyendo Asp3 y Arg5 por Ala. Este nuevo glicopéptido no fue reconocido por SBA, lo que corrobora la importancia de Asp3 y Arg5 en el proceso de reconocimiento. Las conclusiones que se recogieron de este artículo son las siguientes. • Se ha logrado cristalizar la lectina SBA con distintos antígenos derivados de MUC1 • Se han observado dos modos de unión diferenciados por la conformación del enlace glucosídico • Los residuos de Asp y Arg en la secuencia PDTR parecen fijar la conformación tanto del péptido como del carbohidrato para maximizar las interacciones con las lectinas El objetivo del segundo artículo pretende caracterizar las bases moleculares de cómo el antígeno 1SM3-ScFv reconoce a los antígenos que contengan serina o treonina. Este artículo se publicó en 2015, en la revista ANGEWANTE COMMUNICATIONS (PMID: 26118689). El primer paso de este artículo consistió en la elección de un fragmento del anticuerpo adecuado y funcional derivado de 1SM3, para proceder a su expresión y purificación, posteriormente poder realizar una serie de ensayos de afinidad con distintos glicopéptidos y obtener su estructura cristalina para analizar su interacción. Los anticuerpos son modulares y se pueden extraer sus dominios por separado. Nosotros elegimos usar una proteína de fusión o fragmento variable de cadena sencilla, formada por los módulos terminales del brazo Fab del anticuerpo, cada uno de una cadena, ligera y pesada. Este método resulta más fácil de expresar y menos costoso económicamente. Una vez seleccionado el fragmento, lo clonamos, expresamos y purificamos. El clonaje se llevó a cabo en primer lugar en bacterias, y aunque se consiguió expresar, la purificación no era óptima por lo que se optó por el uso de levaduras. El plásmido clonado que contenía la construcción se transfectó por electoporación en Pichia Pastoris, cepa X33. Una vez seleccionada la colonia que expresaba la proteína de fusión, se expresó en gran cantidad y purificó mediante una columna de afinidad a níquel, ya que la construcción poseía una cola de histidinas, seguida de una cromatografía de exclusión molecular para eliminar impurezas. Para los ensayos de asociación se utilizaron estos 4 péptidos largos, tanto desnudos como glicosilados. Sin embargo, para obtener las estructuras cristalográficas se utilizaron modelos simplificados de los mismos, siendo estos el menor epítopo reconocido por el anticuerpo anti- MUC1. Primero se analizó la influencia de GalNAc en la unión al anticuerpo por Interferometría de biocapa (BLI). Se observó una afinidad tres veces mayor para el glicopéptido de treonina frente al péptido de treonina sin glicosilar para el fragmento purificado de 1SM3. Los péptidos y glicopéptidos con serina muestran una afinidad muy inferior en comparación con la Thr. Estos resultados han sido corroborados por ensayos ELISA obteniendo los mismos resultados para el anticuerpo comercial, lo que corrobora que el fragmento se posee la misma afinidad que el anticuerpo completo. Se obtuvieron tres estructuras cristalinas del fragmento del anticuerpo con tres glicopéptidos distintos. Todos muestran una buena unión del péptido independientemente de la presencia del azúcar. La conformación también es prácticamente idéntica para los 3 (1, 1* y 2*). La presencia de GalNAc apenas afecta a la conformación del esqueleto peptídico unido al anticuerpo 1SM3. Los contactos estabilizantes están formados por puentes de H, algunos de ellos formados por moléculas de agua y las que se describen a continuación. Se forman interacciones CH-pi de la Pro2 con Trp91L, Trp96L y Tyr32L. Las cadenas laterales de Asp3 y Arg5 interaccionan con puentes de H con el Trp33H y Tyr32H respectivamente. También para 1* y 2* se forman los siguientes enlaces. La amina de Ala1 y el grupo carbonilo de Thr4/Ser4 forman puentes de H con Tyr32L y Gln97H, respectivamente. La presentación de la cadena lateral de Arg5 en el glicopéptido 2* difiere significativamente de sus análogos. No forma puente de H entre la cadena lateral (Arg5) y el grupo carbonilo de Asn31H. Esta interacción, además de otros factores, pueden ser la causa de la baja afinidad de 1SM3 con 2*. La mayor diferencia entre la unión de 1SM3 con los glicopéptidos 1* y 2* reside en la geometría del enlace glucosídico. 1SM3:1* adopta una conformación exo-anomerica/syn esperada, con valores de fi y psi en torno a 63º y 91º, respectivamente. Esta conformación es la que se observó en la unión del glicopéptido ajeno a MUC1 con 237-mAb y entre SBA y 1* (Artículo I). Esta geometría permite la formación de un puente de H intermolecular entre el grupo hidroximetilo de GalNAc (O6) y la cadena lateral de Tyr32L de 1SM3. El grupo N-acetilo del azúcar interacciona con el anillo aromático de Trp33H que proporciona la selectividad de 1SM3 para los antígenos que contienen GalNAc. Sin embargo, GalNAc en el compuesto 2* no establece contactos estabilizadores con el anticuerpo. El enlace glucosídico muestra una conformación de alta energía. Esta conformación es más común para O-alfa-GalNAc-Ser en solución, observada por RMN y MD experimental. Las conclusiones que se recogieron de este artículo son las siguientes. • Se ha conseguido expresar en suficiente cantidad el 1SM3_ScFv usando Pichia pastoris como sistema de expresión. • Se ha demostrado que el fragmento ScFv se comporta de manera muy similar al anticuerpo completo • Se ha logrado cristalizar el anticuerpo 1SM3_ScFv con diferentes péptidos. • Se ha observado una mejor afinidad de 1SM3 con Thr glicosilada frente a Thr sin glicosilar. • Se ha observado una mejor afinidad del anticuerpo 1SM3 con el péptido que contiene Thr glicosilada frente a Ser glicosilada. El objetivo del tercer artículo se centra en el diseño racional de nuevos antígenos Tn en los que el oxígeno del hidroxilo de treonina y serina es reemplazado por azufre y que además contengan “linkers” entre el aminoácido y el carbohidrato para la obtención de mejores vacunas. Este artículo se publicó en 2016, en la revista THE JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY (DOI:10.1021/acs.joc.6b00833). La glicosilación de GalNAc ha mostrado en serina y treonina que fuerza conformaciones extendidas (en solución), debido a que se forman interacciones estabilizantes entre el azúcar y el péptido. Por ello se han desarrollado glicopéptidos con linkers más largos además de la presencia de un átomo de azufre uniendo al azúcar. Las interacciones en solución que muestran estos glicopéptidos entre el azúcar y la cadena péptidica son insignificantes, ya que muestran un enlace S-glucosídico más flexible y una cadena lateral que también lo es. Además, el linker se localiza perpendicularmente al esqueleto peptídico. Solo se consiguió la estructura cristalina de la proteína de fusión con en glicopéptido 22 del artículo y se analizó su estructura cristalina con SM3. Los puentes de H y los contactos hidrofóbicos de los glicopéptidos naturales (APDT*RP) se mantienen con 22. El aminoácido de prolina se une a Trp91L, Trp96 y Tyr32L. Las cadenas laterales de Asp3 y Arg5 forman uniones hidrófobas con Tyr33H y Tyr32H, respectivamente. El grupo amino (NH) de Ala1 y el grupo carbonilo de Thr4 forman puentes de H con Tyr32L y Gln97H, respectivamente. También se forma un puente de H entre la cadena lateral de Arg5 y el grupo carbonilo de Asn31H. La conformación del fragmento del péptido 22 unido al anticuerpo es idéntica a la observada con los glicopéptidos naturales, indicando que el menor impacto del linker sobre la conformación del péptido en estado sólido. La estructura del linker y GalNAc no pudo ser resuelta por densidad electrónica debido al elevado grado de flexibilidad del “linker”. Las conclusiones que se recogieron de este artículo son las siguientes. • Se ha cristalizado el fragmento 1SM3_ScFv conjuntamente con derivados del antígeno Tn que poseen “linkers” de distintas longitudes que unen el azúcar (GalNAc) al péptido a través de un átomo de azufre. • La presencia de estos “linkers” entre la cadena principal del péptido y el azúcar impide las interacciones intramoleculares, lo que favorece potencialmente la presentación del azúcar para los eventos de reconocimiento molecular. El objetivo del cuarto artículo trata la modificación de la prolina del APDT*RP para mejorar su reconocimiento por parte de los anticuerpos anti-Tn con el fin de usarlos para el diagnóstico de cánceres asociados al antígeno Tn. Este artículo se publicó en 2017, en la revista JACS (DOI: 10.1021/jacs.8b04801). La prolina posee un rol central en la estabilización del complejo antígeno anticuerpo uniéndose a Trp91L, Trp96L y Tyr32L. Esto explica la importancia de esa posición de Pro para la unión a varios anticuerpos anti-MUC1. Estudios recientes han mostrado como los enlaces CH/pi pueden ser potenciados por un aumento de polarización de CH. Se pretende sustituir prolina por derivados de prolina como (4S)-4-fluoro-L-Prolina o 4,4- difluoro-L-prolina para potenciar la afinidad antígeno anticuerpo. Por BLI, se analizó el impacto de la sustitución de H -> F en la asociación con la proteína de fusión de 1SM3. El glicopéptido natural muestra una mejor afinidad que el péptido natural sin glicosilar. El glicopéptido sustituido por un flúor (fP*) presenta una interacción ligeramente mejor que el glicopéptido sustituido por dos flúor (2fP*) y ambos mejor que P*. A su vez mejores estos glicopéptidos presentan mejor afinidad que los mismos péptidos sin glicosilar. Por la técnica de microarrays, con varios anticuerpos comerciales (1SM3 y VU-3C6), se ha obtenido el mismo resultado que por BLI, lo que indica que se produce un modo de unión equivalente en el reconocimiento del antígeno. Para su cristalización se utilizaron variantes simplificadas de fP* (GVTSAfPDT*RPAP)=fP*’ La conformación que se observa en la estructura cristalina es idéntica al artículo II o el péptido APDT*RP, sugiere que el flúor no modifica significativamente la estructura del péptido en el estado sólido. Las interacciones entre el esqueleto peptídico con el fragmento del anticuerpo son idénticas a los anteriores, lo que indica que GalNAc glicosilada no influye en el acomodamiento del residuo clave Pro. La distancia del centro del anillo (4S)-4-Fluoro-L-prolina y el Trp91L era significativamente más pequeña que la observada en Pro-Trp de otros complejos. Esto da peso a la premisa inicial que mejora la estabilidad de los complejos que se forman frente a los antígenos no naturales con flúor. También se analizaron por MD los antígenos de 2fP*’ y fP*’. Se obtuvo una distancia de 4.1 y 4.0 respectivamente frente a los 4.7 del glicopéptido natural P*’. Los datos experimentales y teóricos validan y muestran que al mejorar la interacción Pro/Trp a través de sustituciones simples de H -> F representan una forma sencilla de estabilizar el complejo con el anticuerpo. Estos resultados insinúan que los glicopéptidos de MUC1 con colas de flúor pueden ser empleados como antígenos potenciales para la eficiente detección de anticuerpos anti-MUC1. Para probarlo, se realizó un ensayo indirecto ELISA usando P* y 2fP* como antígenos de recubrimiento para detectar anticuerpos anti MUC1 del suero de pacientes con tumores de próstata tanto benignos como malignos. La señal detectada con los antígenos 2fP* resultó más elevada que para la prolina glicosilada en los casos de adenocarcinoma e hiperplasia benigna. También se muestra una mayor concentración de anticuerpos antiMUC1 en tumores malignos, de acuerdo con otros ensayos de cáncer de mama. A la vista de estos resultados podemos concluir, el antígeno de 2fP* presenta una aplicación potencial como biomarcador para la detección mejorada de anticuerpos antiMUC1 circulantes en el suero de pacientes. Las conclusiones que se recogieron de este artículo son las siguientes. • Fragmento 1SM3_ScFv cristalizado conjuntamente con un derivado del antígeno Tn que contiene fluoroprolina • La sustitución H → F mejora la interacción clave CH-π, que es crucial para mejorar la unión del antígeno al anticuerpo • Los antígenos generados en este artículo mejoran la detección de anticuerpos anti-MUC1 en muestras de suero de pacientes con cáncer de próstata El objetivo del sexto y último artículo el diseño racional de nuevos antígenos Tn en los que el oxígeno del hidroxilo de Ser/Thr es reemplazado por S/Se con el fin de obtener mejores anticuerpos anti-Tn. Este artículo se publicó en 2019, en la revista JACS (DOI: 10.1021/jacs.8b13503). Se diseñaron glicopéptidos que se diferenciaban del natural en la sustitución del átomo de O del enlace glucosídico por S y Se. Una distancia mayor entre el azúcar y el péptido va a alterar la flexibilidad y la conformación del enlace glucosídico al más óptimo para el anticuerpo. Se realizaron ensayos conformacionales por MD y RMN demostraron que tenían distinta geometría en sus enlaces glicosídicos relativos al original que excluye una interacción efectiva entre el esqueleto peptídico y el azúcar. Respecto al esqueleto peptídico, 2* y 3* muestran estructuras plegadas a al Thr4 (S/Se). Esto difiere de 1* que muestra una estructura de lámina beta extendida en solución debido a los puentes de H entre el esqueleto y el azúcar. Así, la energía conformacional requerida asociada al cambio conformacional desde extendido en solución a plegado en el estado sólido se espera que sea mínima. El estudio conformacional detallado muestra como la estructura de 2* y 3* esta preorganizada previamente (en solución) para la unión, a diferencia de 1*. Para confirmar este hecho, se calcularon las constantes de disociación por SPR. Las mejores afinidades se mostraron para 2* y 3* frente a 1* a 25º C. La variación de afinidad del péptido 1* con la temperatura es mayor que los glicopéptidos no naturales. Esto parece indicar que existe alguna penalización entrópica asociada a la unión con 1* y ensalza el comportamiento inherente de 2* y 3*, como se vio en RMN y MD. La estructura cristalina revela que la conformación de unión a 1SM3 es prácticamente idéntica a 1* (en estado sólido). Esto demuestra que el anticuerpo reconoce la conformación bien definida del epítopo, independientemente de la naturaleza del aminoácido glicosilado. Al igual que ocurre en 1*, 2* y 3 también se estabilizan por puentes de H mediados por H2O o intermoleculares. El glicopéptido 2* presenta dos modos de unión con 1SM3 que difieren en la geometría del enlace glucosídico por eso la densidad electrónica no pudo ser calculada y ajustada. Lo mismo ocurre en el caso del glicopéptido 3*. A la vista de los resultados obtenidos, se planteó la posibilidad de probarlo en una vacuna. Para ello, el glicopéptido que se diseñó contenía el tándem completo de la secuencia de MUC1 añadiendo SThr glicosilada, lo cual mejora la preorganización de la estructura del epítopo (mejora entrópica). También se incluye la sustitución de prolina por fluoroprolina que produce una mejora de la unión del antígeno con el anticuerpo, (por suponer una mejora entálpica). Para su administración, se conjugaron a nanopartículas de oro recubiertas de polietilenglicol (PEG). Estas nanopartículas ya habían sido probadas y suponían una serie de ventajas para su administración. No necesitan adyuvante y son el transportador del antígeno, poseen una baja toxicidad y producen una elevada respuesta inmunogénica. La vacuna se administró en un grupo de 5 ratones en una primera dosis con 3 de refuerzo en intervalos de 21 días. Se mantuvo un grupo de control al que se administraba PBS. El análisis del antisuero mostró que se había producido una respuesta significativa de anticuerpos IgG antiMUC1, siendo IgG1 el isotípo predominante, lo que sugiere que las respuestas inmunes Th2 fueron las predominantes inducidas por las nanopartículas de oro con el glicopéptido. También se observó un aumento de IgMs, lo que sugiere un cambio recombiante de clase incluso sin el uso del epítopo universal de CD4-T que suele utilizarse en el desarrollo de estas vacunas. Para confirmar que los anticuerpos generados eran capaces de reconocer el antígeno MUC1 original en células de tumor, se usaron dos líneas celulares humanas (MCF-7 y T47D) y HEK293T para incubar con los anticuerpos y fueron analizarlos por citometría de flujo. Este gráfico muestra como los anticuerpos reaccionaron frente ambas líneas celulares tumorales y nada frente a HEK293T. Por microscopía confocal y con un anticuerpo secundario marcado con una sonda fluorescente se muestra la presencia de MUC1 en la superficie de ambas líneas celulares. Por último, se comparó la muestra de una biopsia de un paciente de cáncer de mama, con un paciente sano, mostrando el mismo resultado. MUC1 se visualiza únicamente en la superficie de las células del paciente con cáncer de mama. Las conclusiones que se recogieron de este último artículo son las siguientes. • El fragmento 1SM3_ScFv ha sido cristalizado conjuntamente con derivados del antígeno Tn en los que un átomo de oxígeno del hidroxilo de la Thr se sustituye por un átomo de azúfre o de selenio. Adicionalmente estos glicopéptidos están modificados con prolinas sustituidas por (4S)-4-fluoro-L-prolina • Una sustitución de la prolina sustituida por (4S)-4-fluoro-L-prolina combinado con la sustitución del oxígeno por azufre u oxígeno por selenio en la Thr permite que el esqueleto del péptido adopte una estructura preorganizada que sea óptima para el reconocimiento por anticuerpos • Los antisueros de ratones vacunados con AuNP-12 reconocen las células cancerosas con alta selectividad