Biological evaluation of new antitumour agentsstudy of the interaction with matrix metalloproteinases and estrogen receptors

Résumé

El descubrimiento de nuevos fármacos es un proceso muy complejo. La investigación inicial genera datos que permiten proponer una hipótesis, por ejemplo, que la inhibición de una proteína o de una vía de señalización pueden causar un efecto terapéutico contra una enfermedad en particular. El primer paso en el proceso es la búsqueda de una molécula con actividad en la diana elegida, usualmente llamada líder o candidato, que progresará más tarde en preclínica y, si tiene éxito, en desarrollo clínico. Actualmente, los ensayos más ampliamente utilizados en la identificación de un compuesto líder son ensayos bioquímicos basados en la diana, que definen la actividad específica o la afinidad de los compuestos ensayados en la diana, y ensayos basados en células que generan una lectura funcional de la actividad del compuesto. En esta tesis se seleccionaron las Metaloproteinasas de la Matriz y los Receptores de Estrógeno como dianas para el diseño de fármacos antitumorales y se evaluó la actividad biológica de nuevos ligandos diseñados y sintetizados en nuestro grupo de investigación. Por otra parte, se propuso un nuevo modo de regulación de la actividad de la metaloproteinasa de la matriz de tipo 2 (MMP-2). Las metaloproteinasas de la matriz tienen múltiples y a veces contradictorios efectos en el progreso del cáncer. En la actualidad sólo hay tres MMPs que están validadas como dianas para la terapia del cáncer: MMP-1, MMP-2 y MMP-7. Hay muchos ensayos in vivo que apuntan a la MMP-2 como diana para la terapia anti-cáncer, mientras que la MMP-9 se comporta como anti-diana en etapas avanzadas de la enfermedad. En nuestro grupo estamos interesados en el diseño de nuevas moléculas con selectividad hacia MMP-2, y en especial sobre MMP-9. Este es un objetivo muy ambicioso debido a que ambas enzimas comparten una estructura muy similar en su hueco catalítico. Con este objetivo se diseñaron una serie hidroxamatos de sistemas de alfa-sulfona,alfa-tetrahidropirano basados en datos de la literatura sobre inhibidores selectivos de MMP-2 y explotando el potencial de la química clic. En este trabajo se evaluaron los compuestos sintetizados como inhibidores de MMP-2 y MMP-9 utilizando diferentes metodologías. Entre los nuevos inhibidores, un compuesto presenta un perfil prometedor, con actividad nanomolar en MMP-2 y MMP-13. Este compuesto es inactivo en MMP-1 y MMP-7, y presenta una actividad 70 veces más baja en MMP-9. A continuación se estudió la actividad biológica de otra nueva serie de ácidos hidroxámicos, con estructura de alfa-piperidina-alfa-sulfona, diseñados para mejorar la solubilidad en agua de los inhibidores de hidroxamato mencionados anteriormente. Este estudio permitió el descubrimiento de un compuesto con una potente inhibición de MMP-2, un buen perfil de selectividad sobre otras MMPs, incluyendo MMP-9 y propiedades farmacocinéticas mejoradas (solubilidad en el rango mg/mL). Por otro lado, se realizaron otros experimentos con el objetivo de mejorar el perfil de selectividad MMP-2/MMP-9 de este compuesto. La mayor plasticidad de la parte posterior del bolsillo S1' de MMP-2 que se observó en los estudios computacionales, permitió proponer que los sustituyentes voluminosos podrían encajar mejor en esta enzima que en MMP-9. Estos resultados se utilizaron para diseñar un nuevo inhibidor de la MMP-2 con una selectividad sobre MMP-9 mayor de 100. BiPS es un potente inhibidor comercial de MMP-2 derivado de fenilalanina pero que carece de selectividad frente a MMP-9. Siguiendo una estrategia similar a la utilizada en los casos anteriores se diseñaron y sintetizaron nuevos análogos, donde uno de los anillos de fenilo se sustituyó por un resto triazol con grupos P1' adecuados para obtener selectividad en las diferentes gelatinasas. De esta forma se obtuvo un compuesto con alta potencia en MMP-2 e inactivo en MMP-9 y MMP-1. Se demostró que la actividad de este compuesto racémico se debe principalmente al enantiómero (R), mientras que el enantiómero (S) es mucho menos activo. Se ha descrito que el anillo de tiirano es un ZBGs útil para el diseño de inhibidores selectivos de MMP-2. Por esta razón, hemos evaluado la actividad en gelatinasas de una serie de tiiranos obtenidos por química clic, en los que el fragmento que contiene la azida y el ZBG se conectó a una serie de alquinos diseñados para interactuar con los residuos lipófilos del bolsillo S1'. El mejor compuesto mostró un CI50 en MMP-2 del orden submicromolar en un ensayo colorimétrico, mejorando sustancialmente la potencia de otros tiiranos previamente descritos vía química clic. El ácido gálico y las antocianinas son productos naturales que se encuentran presentes en muchas frutas y verduras. En la bibliografía está descrito que el ácido gálico posee propiedades citotóxicas en varias líneas celulares de cáncer e inhibe la carcinogénesis en modelos animales. El objetivo de este estudio fue determinar si ácido gálico y antocianinas tienen actividad citotóxica frente celulas HT1080 y si estas propiedades citotóxicas pueden estar relacionadas con capacidad para inhibir gelatinasas. En primer lugar se determinó que tanto el ácido gálico como la delfinidina 3-glucósido presentaban citotoxicidad selectiva hacia células HT1080. El ensayo de migración e invasión mostró actividad anti-invasiva para el ácido gálico, y delfinidina y pelargonidina-3-glucósidos. A continuación se determinó la actividad inhibitoria del ácido gálico y de las antocianinas sobre gelatinasas en células HT1080 mediante zimografía y se observó que el ácido gálico inhibe la actividad y secreción de MMP-2 y MMP-9. Además, el ácido gálico inhibió la actividad proteolítica (con peptido como sustrato) de MMP-2 y MMP-9 recombinantes con una potencia similar. Finalmente, los experimentos de modelado molecular y RMN confirmaron la interacción del ácido gálico con MMP-2, sugiriendo que dicha interacción tiene lugar en el sitio catalítico. Otro aspecto estudiado en este tesis es la regulación de MMP-2 a través de la fosforilación mediada por CK2. Se conoce que la MMP-2 está regulada por la fosforilación mediada por la proteína quinasa C y que esta modificación afecta a sus propiedades enzimáticas, aunque el papel de este proceso en el control de su actividad está aún por establecer. En esta área, nuestro objetivo era comprobar si la proteína quinasa CK2 podría ser otro posible modulador de la actividad de MMP-2. La proteína quinasa CK2 es una proteína ubicua, constitutivamente activa y altamente conservada, responsable de la fosforilación de cientos de proteínas in vitro e in vivo. Se usaron aproximaciones bioinformáticas y métodos bioquímicos para definir el posible lugar fosfoaceptor en MMP-2. Un ensayo estándar para la fosforilación in vitro con gammaP32-ATP, condujó a la fosforilación de MMP-2, y dicho proceso fue inhibido en presencia de un inhibidor específico de CK2 (TBB). El análisis, mediante espectrometría de masas, de MMP-2 fosforilada in vitro reveló que la fosforilación tenía lugar únicamente en la Ser205. El análisis por zimografía demostró que la actividad de MMP-2 se ve afectada significativamente por la fosforilación. En un ensayo funcional en células de fibrosarcoma humano (HT1080), se observó que la actividad de MMP-2 aumenta cuando se inhibe CK2 con TBB. El tratamiento de células HT1080 con estaurosporina, un inhibidor de quinasas de amplio espectro (CK2 es relativamente refractario a su actividad), no afectó a la actividad de MMP-2, indicando que el aumento observado empleando TBB puede ser debido a la interacción selectiva con CK2. Estos resultados sugieren la existencia de un nuevo mecanismo regulatorio entre MMP-2 y CK2. Con el propósito de buscar esqueletos útiles para el diseño de nuevos moduladores de los receptores de estrógeno (SERM), nuestro grupo de investigación inició un programa dirigido a la síntesis de sistemas tetracíclicos que contienen un átomo de oxígeno o de azufre, y un sustituyente ciano adicional, que podría ser utilizado para introducir las cadenas básicas adecuadas para la actividad antagonista. Se encontró que dos compuestos, con una selectividad modesta frente a REbeta, se comportan como agonistas de REbeta y antagonistas de REalfa, y presentan una actividad antitumoral interesante contra dos líneas de células pancreáticas. En un segundo paso, estos agonistas REbeta se convirtieron en antagonistas por la introducción de las cadenas laterales básicas presentes en el tamoxifeno, el raloxifeno y otros antagonistas descritos en la literatura. Los estudios de modelado molecular en los compuestos indicaron una unión preferente en REbeta, y presentaron modos de unión con interacciones entre la cadena lateral básica y el carboxilato del Asp303 de la hélice-12. Entre estos nuevos ligandos, dos compuestos presentan un perfil prometedor, con actividad micromolar como antagonistas de REbeta en un ensayo funcional basado en células, y carecen de actividad en REalfa en el mismo intervalo de concentración. Como hay pocos ejemplos de ligandos con este perfil antagonista-beta selectivo, esta capacidad que presentan los compuestos descritos de anular la acción de los estrógenos a través de REbeta, sin tener ningún efecto en su actividad a través de REalfa, podría ser utilizado para diferenciar las funciones biológicas de ambos subtipos de RE. El segundo objetivo en esta área, fue la evaluación de la actividad de una serie de derivados de triazol sintetizados mediante química clic. Los triazoles pueden ser considerados como bioisósteros de olefinas trans. Por ejemplo, la sustitución de las olefinas trans por un anillo de triazol en el resveratrol no afecta a la orientación espacial de los grupos hidroxilo fenólicos, que son cruciales para la actividad biológica observada. Por lo tanto, se decidió estudiar el perfil biológico de dos series de 1,4-bis(hidroxifenil)-1H-1,2,3-triazoles sintetizados en nuestro grupo, donde los grupos metilo, trifluorometilo, flúor, carboxilo y metoxicarbonilo se introdujeron en posición orto y meta de uno de los anillos aromáticos. Se encontraron dos compuestos que se comportan como agonistas REbeta selectivos. Estos compuestos pueden ser útiles para el estudio de la actividad fisiológica de REbeta. Uno de ellos no mostró actividad proliferativa y constituye, por lo tanto, un nuevo y prometedor candidato para el desarrollo de agentes de unión a RE útiles para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, cardiovasculares y del sistema nervioso central.