Detección molecular de listeria monocytogenes en carne de polloestudio de la diversidad genética y virulencia de cepas aisladas

Laburpena

Listeria monocytogenes es un microorganismo patógeno cuya enfermedad se asocia principalmente al consumo de alimentos contaminados, debido a lo cual L. monocytogenes se ha convertido en los últimos años en uno de los microorganismos más importantes para la industria alimentaria. En el presente trabajo se ha analizado, en un primer ligar, la detección de células de L. monocytogenes dañadas subletalmente utilizando carne de pollo como alimento modelo. Se desarrolló un método de PCR y RT-PCR nested sin aislamiento de DNA o RNA. La RT-PCR nested permitió diferenciar específicamente las células viables de L. monocytogenes, aunque únicamente mediante la combinación de un enriquecimiento de 24 horas en medio líquido selectivo con la detección por PCR fue posible alcanzar un nivel de sensibilidad próximo al del protocolo de cultivo (1 UFC/g), siendo posible acortar el tiempo de detección a sólo 30 horas. Combinando un enriquecimiento en medio líquido no selectivo con la enumeración de colonias en placas de los medios cromogénicos ALOA y ALOA suplementado con un 4% de NaCI, se desarrolló un método que permitió la detección de células de L. monocytogenes dañadas subletalmente en carne de pollo procesada mediante altas presiones. La segunda parte del trabajo consistió en el desarrollo de un método de PCR a tiempo real con SYBR Green I para estudiar la contaminación natural por L. monocytogenes de muestras comerciales de carne de pollo. La incidencia fue similar a la obtenida mediante cultivo (70%), sim embargo, se encontraron muestras con resultados discrepantes entre ambos métodos de detección. El limitado crecimiento de L. monocytogenes en el enriquecimiento primario originó resultados negativos falsos de la PCR a tiempo real, mientras que el número elevado de UFC de otras especies del género Listería en el enriquecimiento secundario fue la causa de resultados negativos en ALOA. La utilización de diferentes protocolos de enriquecimiento no mostró diferencias significativas respecto a la incidencia detectada con cada uno, pero su combinación permitió aumentar de forma significativa el número de muestras positivas. La diversidad genética de cepas de L. monocytogenes aisladas de los productos comerciales de carne de pollo pudo afectar a la detección de L. monocytogenes en cada muestra. En una selección de 45 aislados, procedentes de hamburguesas de pollo comerciales de diferentes fechas, se identificaron 11 pulsotipos o cepas distintas (R1 a R11). La presencia de codones prematuros de parada en la secuencia del gen de la internalina A de tres de las cepas (R1, R8 y R10) se relacionó con la ausencia de la proteína completa, así como con la escasa invasión de células humanas (LoVo). La cepa R10 fue la única que careció de actividad hemolítica y lecitinasa, fue incapaz de multiplicarse intracelularmente en células en cultivo, y fue avirulenta en ratones inmunocomprometidos. La secuenciación del gen del regulador central de la virulencia PrfA de la cepa R10 reveló la existencia de una inserción de 7 nucleótidos en el codón 171, mutación que permite explicar la pérdida de la capacidad patogénica en esta cepa de L. monocytogenes aislada de alimentos.