Muerte celular programada y expresión génica en biología reproductiva de "Actinidia chinensis var. deliciosa"

Résumé

El kiwi (Actinidia chinensis var. deliciosa) es una especie de origen asiático, aunque en la actualidad su cultivo está extendido a otras zonas del mundo dado el valor nutricional de sus frutos. Una de las mayores limitaciones para su comercialización es la obtención de frutos con un tamaño óptimo, el cual está directamente relacionado con el número de semillas y, por lo tanto, con polinización. Esta especie es dioica, por lo que los procesos de polinización se ven limitados por un desfase temporal de la floración entre los cultivares masculinos y femeninos, y por el corto periodo efectivo de polinización (PEP) de la especie. En relación con los periodos de floración, se secuenciaron los genes de fotorreceptores AcPHYA, AcPHYB y AcCRY2, caracterizados por su implicación en la regulación por luz de la floración y se analizaron sus patrones de expresión bajo diferentes condiciones de fotoperiodo natural. Los resultados obtenidos revelaron la regulación de su expresión por fotoperiodo, con diferencias significativas en los patrones de expresión entre diferentes condiciones de fotoperiodo. También se encontró una correlación positiva entre sus patrones de expresión, y los del gen AcFT, cuya proteína es el principal componente del florígeno en otras especies, durante las etapas finales de diferenciación floral, que culminan con la antesis en la segunda estación de crecimiento; y con la evocación floral durante la primera estación de crecimiento. Además, el patrón de expresión de estos genes apunta a su relación con otros procesos fisiológicos, como crecimiento vegetativo y senescencia foliar. Los análisis de hibridación in situ de estos fotorreceptores determinanron que la localización espacial de sus transcritos está asociada a haces vasculares. En relación con el corto periodo efectivo de polinización se llevó a cabo, en brazos estigmáticos de flores polinizadas y no polinizadas, el estudio de marcadores histoquímicos y moleculares relacionados con muerte celular programada (PCD). Los resultados observados evidencian degeneración celular, aumento del tamaño vacuolar, encogimiento del protoplasto, degradación de orgánulos, condensación de la cromatina, pérdida de núcleos, fragmentación del ADN y actividad tipo caspasa. Todos estos marcadores de muerte celular se observaron tanto en flores polinizadas como no polinizadas, asociado a la fase progámica y al PEP, respectivamente. Los resultados obtenidos apuntan a un programa de PCD como responsable de limitar el PEP, pero también de facilitar el crecimiento de numerosos tubos polínicos, contribuyendo al éxito reproductivo de la especie. En vista de los resultados obtenidos en relación a los procesos de PCD, se estudio la expresión de genes implicados en la ruta de síntesis y señalización del etileno, hormona ampliamente relacionada con procesos de muerte celular. Los análisis de expresión relativa se realizaron en brazos estigmáticos de flores polinizadas y no polinizadas. Los resultados obtenidos muestran altos niveles de expresión antes de la apertura de la flor, durante la penetración y el avance de los tubos polínicos en flores polinizadas y durante el PEP en flores no polinizadas. Estos resultados apuntan a la implicación del etileno en los procesos de PCD, pero la expresión tardía de algunos de los genes analizados podrían relacionar el etileno con procesos que ocurren en otros órganos florales con posterioridad. Para realizar los estudios de expresión relativa, tanto de genes asociados con procesos de floración como de genes relacionados con etileno, fue necesaria una selección previa de genes de referencia adecuados para los análisis de PCR en tiempo real. Para ello se analizaron, en diferentes tejidos de kiwi, varias parejas de cebadores para diferentes genes de referencia (ACTINA, 18S ribosomal, UBIQUITINA). Los resultados obtenidos, utilizando los programas geNorm, NormFinder y BestKeeper, muestran como mejores genes de referencia ACTINA y 18S ribosomal.