Embriogénesis somática en la vidcontrol de la maduración de los embriones somáticos y generación de nueva variabilidad in vitro

Resumen

En esta tesis se establece un protocolo eficiente de regeneración de plantas mediante embriogénesis somática a partir de filamentos de estambres de vid (cv. Mencía) empleando TDZ y 2,4-D como inductores de la respuesta embriogénica. Se estudió el efecto del tamaño de inóculo en la maduración y la germinación precoz de los embriones somáticos, y se encontró que es posible controlar ambos a partir de la manipulación del tamaño de los inóculo en el medio de maduración. El análisis de los niveles de ploidía y el contenido de ADN nuclear mediante citometría de flujo de las plantas regeneradas a partir de este protocolo reveló que el mismo induce bajas tasas de variación somaclonal que se manifiesta fundamentalmente mediante la poliploidización espontánea y la reducción del material genético durante la embriogénesis somática. Se estudió detalladamente la maduración de los embriones somáticos de vid en medio de cultivo con diferentes concentraciones de sacarosa y sobre una membrana semipermeable. Los análisis del contenido de agua, la expresión de VvNCED1 y el contenido de ABA y ABA-GE demostraron que la maduración de los embriones somáticos de vid está fuertemente regulada por la disponibilidad de agua en el medio de cultivo. Se detectaron dos picos de acumulación de ABA durante la maduración de los embriones somáticos sobre la membrana. El primero se manifiesta al comienzo de la maduración y está relacionado con la sobreexpresión del gen VvNCED1 inducida por cambios en el contenido de agua de los embriones. Una vez estabilizado el contenido de agua, los expresión de VvNCED1 se reduce hasta su nivel basal y el contenido de ABA cae bruscamente. Un segundo pico de acumulación de ABA al final de la maduración no se relaciona con la expresión de VvNCED1, ni con cambios en el contenido de agua de los embriones, por lo que es probable que se haya reclutado otro gen de la familia NCED1 para la regulación de la biosíntesis de ABA. La aplicación de ABA exógeno en los cultivos sobre la membrana produjo una supresión de la expresión de VvNCED1, lo que sugiere que en alguna medida la regulación de la expresión de este gen podría estar mediada por ABA. Se estableció un protocolo de mutagénesis in vitro inducida por EMS a partir de una suspensión celular embriogénica y se empleó por primera vez el análisis de las curvas de disociación de alta resolución (HRM) para la detección de mutaciones puntuales en plantas leñosas. El EMS afectó tanto la supervivencia como la capacidad de regeneración de plantas de las suspensiones celulares a dosis mayores de 3 mM. El análisis de las curvas de disociación de un fragmento de 1000 pb del gen VvNCED1 permitió la detección de una mutación en de masas embriogénicas derivadas de las suspensiones tratadas con EMS. Esta mutación fue posteriormente confirmada mediante secuenciación, demostrando la efectividad del EMS en la obtención de poblaciones mutagenizadas de vid. La mutagénesis inducida por EMS podría ser de gran interés para la genómica funcional en la vid, pero hasta hoy todavía no ha sido empleada para este fin. Por último, en este trabajo se estableció un protocolo eficiente para la regeneración de plantas poliploides de vid a partir del tratamiento de una suspensión embriogénica con colchicina. El interés en la obtención de poliploides en la vid se basa en su utilidad para el mejoramiento genético, debido a que las plantas poliploides podrían tener un crecimiento más vigoroso y podrían dar frutos más grandes o sin semillas. Los trabajos sobre poliploidización in vitro en la vid son muy escasos y están limitados a unas pocos cultivares. El protocolo descrito en este trabajo permitió la obtención eficiente de plantas poliploides y con una gran variabilidad en el contenido de ADN nuclear.