Cistatinas de cebadaproteínas de defensa contra artrópodos

Resumen

Las cistatinas son un grupo de proteínas identificadas en animales, plantas y algunos microorganismos que inhiben cisteín proteasas C1A, de la familia de la papaína. Las cistatinas de plantas o fitocistatinas tienen un papel endógeno relacionado con el intercambio proteico y la muerte celular programada y se ha demostrado que actúan como proteínas de defensa frente a plagas y patógenos. En cebada, Hordeum vulgare L., se ha identificado la familia completa de cistatinas compuesta por trece miembros, HvCPI-1 a 13. Siete de ellos habían sido previamente caracterizados. En este trabajo se ha completado la caracterización de todos los miembros de esta familia de cistatinas y se ha evaluado su actividad frente a artrópodos plaga. Todas las cistatinas de cebada mantienen conservados el motivo LARFAV, exclusivo de vegetales, y los tres motivos implicados en la unión enzima-inhibidor, aunque en algunos casos con pequeñas variaciones. Además, se ha determinado que la cistatina HvCPI-4 posee una extensión carboxilo terminal con un motivo conservado implicado en la inhibición de cisteín proteasas C13 de la familia de legumaínas. Las estructuras tridimensionales de las cistatinas, se han modelizado a partir de la estructura cristalizada de la orizacistatina I de arroz. Los patrones de expresión obtenidos mediante RT-qPCR han indicado que las cistatinas se expresan principalmente en semilla aunque sus mensajeros también se acumulan en hojas y raíces. Además, se ha determinado la localización subcelular de las trece cistatinas, básicamente detectada en el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi, aunque la cistatina HvCPI-4 aparece también en el núcleo y la HvCPI-1 en el núcleo y el citoplasma. Ensayos de inhibición in vitro frente a cisteín proteasas comerciales tipo catepsina B, H, L y legumaína han mostrado una capacidad inhibitoria diferencial y específica dentro de la familia de cistatinas de cebada. En relación con su función de defensa, se han estudiado los efectos de las 13 cistatinas sobre diferentes especies de artrópodos cuyos enzimas digestivos más abundantes son de tipo cisteín proteasa, dianas potenciales de las cistatinas. Concretamente, se han seleccionado: el escarabajo de la patata, Leptinotarsa decemlineata (Say) y su depredador natural, Podisus maculiventris (Say), la crisomela del maíz, Diabrotica virgifera (LeConte), el ácaro, Tetranychus urticae Koch y dos pulgones, Myzus persicae (Sulzer) y Acyrthosiphon pisum (Harris). Las proteasas digestivas del ácaro y de los pulgones no se conocían de forma detallada, por lo que se ha realizado una caracterización enzimática de estas especies. En todas ellas se ha detectado la presencia de catepsinas L y B y leucin aminopeptidasa pero además, en el caso del ácaro y del pulgón M. persicae se ha detectado también actividad catepsina D y en el caso del pulgón A. pisum se ha detectado actividad carboxipeptidasa. En ninguno de los casos se ha detectado actividad serín proteasa. Se ha determinado la capacidad inhibitoria in vitro de las 13 cistatinas frente a la actividad catepsina L y catepsina B presente en extractos proteicos de estos seis artrópodos, utilizando substratos específicos. Las cistatinas han mostrado diferente especificidad por la actividad de los artrópodos aunque, en general, todas son mejores inhibidores de su actividad tipo catepsina L. La cistatina HvCPI-6 ha resultado ser el inhibidor más potente y ha sido seleccionado para realizar ensayos in vivo con 3 de los artrópodos anteriormente mencionados: T. urticae, M. persicae y A. pisum. Para estudiar la toxicidad en pulgones, se han preparado dietas artificiales suplementadas con cistatina HvCPI-6 y se han analizado la mortalidad y las alteraciones en sus proteasas digestivas. En el caso de A. pisum la ingestión de la cistatina en altas concentraciones provoca la muerte del insecto, muerte que esta asociada a la inhibición de cisteín proteasas digestivas. Por el contrario, en M. persicae no se observa mortalidad a ninguna de las dosis ensayadas, lo que parece estar relacionada con la sobreproducción de proteasas digestivas. Además, se han generado plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana (L.) Heyn, que expresan la cistatina HvCPI-6, para estudiar el efecto que produce sobre M. persicae. Pulgones alimentados con las plantas transgénicas han mostrado un retraso en el desarrollo aunque no se han observado alteraciones en la descendencia. Dado que A. pisum no se alimenta de plantas de arabidopsis, se han realizado bioensayos combinados dieta/plantas de haba para estudiar los efectos de la cistatina sobre el desarrollo y la descendencia de este pulgón. Igual que en el caso de M. persicae se ha observado un retraso en el desarrollo, pero no hay modificaciones en la descendencia. El objetivo final de la utilización de la cistatina como transgen es la obtención de variedades agrícolas más protegidas frente al ataque de plagas y enfermedades. Con este propósito se han generado plantas transgénicas de maíz, Zea mays L., que expresan la cistatina HvCPI-6. Mediante bioensayos se ha podido determinar que la expresión de la cistatina en plantas provoca un retraso en el desarrollo de los ácaros que se han alimentado de las plantas transgénicas, que se correlaciona con una disminución de la actividad tipo catepsina B. Los resultados anteriores, indican que las cistatinas de cebada y en particular la cistatina HvCPI-6, suponen una vía alternativa para el control de plagas y que un estudio exhaustivo de las mismas permitiría considerar la expresión piramidal (gene pyramiding) de los genes que codifican estos inhibidores junto con otros genes con carácter insecticida, para aumentar la resistencia de las plantas al ataque de artrópodos y evitar la adaptación de los mismos.