NMR studies of molecular recognition events related to cancer processes FGFR and tubulin as targets

Resum

Desde el inicio de la aplicación química de La Resonancia Magnética Nuclear (RMN) a principios de los cincuenta, esta técnica espectroscópica ha experimentado un avance espectacular. Y en los últimos años se ha convertido en una herramienta muy útil en la determinación estructural de macromoléculas biológicas (proteínas, ácidos nucleicos e hidratos de carbono), que son los motores principales de la célula viva. La RMN es capaz de proporcionar información estructural de estas moléculas en disolución a nivel atómico, y permite relacionar ésta con su función biológica. Además, la RMN permite tener un conocimiento preciso de la dinámica y de las interacciones moleculares de estas biomoléculas con ligandos de bajo peso molecular, lo que ha llevado al rápido crecimiento de sus aplicaciones en el descubrimiento y desarrollo de fármacos. En este trabajo de Tesis, se ha tratado de implementar las metodologías más actuales de la RMN para la detección y caracterización estructural de procesos de reconocimiento molecular, que incluyen experimentos basados en la observación del receptor y en la observación del ligando. Estos métodos de RMN se han apoyado en distintas herramientas computacionales para proponer modelos tridimensionales de los complejos formados por estas moléculas. Y en particular, se han aplicado métodos de RMN para el estudio de dos sistemas biológicos, intrínsecamente difíciles en su estudio por RMN, relacionados con procesos de alto interés en biomedicina: división celular, cáncer y angiogénesis. En primer lugar, se ha estudiado el sistema formado por los Factores de crecimiento para Fibroblastos (FGF), sus receptores (FGFR), y oligosacáridos de heparina. Se han caracterizado las propiedades conformacionales y dinámicas de oligosacáridos de heparina uniformemente marcados con 15N y 13C en solución, con un método combinado de RMN y cálculos de Dinámica Molecular. Se han realizado experimentos filtrados en 13C y una serie de 15N-1H HSQC para el análisis conformacional y la caracterización de las interacciones de un pentasacárido de heparina, capaz de estimular la actividad mitogénica mediada por FGF1, unido a FGFR-Ig2. Estos resultados experimentales, junto con cálculos de Docking y de Dinámica Molecular, han permitido proponer un modelo del complejo FGFR-Ig2 ¿ heparina (Figura 1). Además, se han caracterizado las superficies de unión de las proteínas que interaccionan en el complejo ternario FGF-heparina-FGFR en solución mediante un protocolo de valoración basado en experimentos HSQC. Finalmente, se ha propuesto un modelo tridimensional para el complejo ternario FGF1¿heparina¿FGFR2-Ig2, mediante datos experimentales, métodos de Docking y cálculos de Dinámica Molecular. Y por otro lado, el estudio por RMN de la tubulina (proteína en su forma no polimerizada y en su forma ensamblada formando microtúbulos) cuando interacciona con diversos agentes estabilizantes de microtúbulos (docetaxel, discodermolido y azatilona). Para ello, se ha utilizado una aproximación combinada de experimentos de RMN STD, tr-NOESY y de modelado molecular. Se ha determinado en cada caso el epítopo de unión del ligando, la conformación bioactiva del mismo, y el número y localización de los sitios de unión involucrados en el reconocimiento (Figura 2). Los resultados han permitido una mayor comprensión de las bases moleculares de la unión de agentes estabilizantes de microtúbulos (MSA) a estados no polimerizados de la proteína, mostrando que los MSA tienen un doble papel ya que no solo estabilizan los microtúbulos una vez formados sino que también promueven la formación de microtúbulos a partir del heterodímero sin polimerizar.