Análisis funcional de genes reguladores R2R3-MYB de "Arabidopsis Thaliana"

Resum

En la presente tesis hemos abordado el analisis funcional de la familia de reguladores de la transcripción R2R3-MYB utilizando como sistema modelo A.thaliana por su utilidad para el analisis genetico y molecular. Con este objetivo, hemos iniciado una estrategia basada en tecnicas de genetica reversa para identificar mutantes en genes de la familia R2R3-MYB, que en A.thaliana se compone de cerca de 100 miembros. Esta estrategia ha consistido en el aislamiento de lineas mutantes mediante el cribado por PCR de colecciones de lineas de A.thaliana mutagenizadas por inserción de T-DNA o transposones. Se obtuvieron inserciones en 10 de los 18 genes analizados, lográndose una eficiencia de cribado cercana a la esperada por calculos teoricos. De esta manera, queda demostrado que en A.thaliana la aproximación por genetica reversa al estudio funcional de miembros de familias genicas es factible desde el punto de vista de la disponibilidad y de la eficiencia de los recursos existentes. Los mutantes encontrados en éste y en similares trabajos consituyen el punto de partida para el análisis sistemático de la función de los miembros de la familia de factores transcripcionales R2R3-MYB. Mediante la construcción razonada de múltiples mutantes se facilitar dicho estudio ya que se sortearon los fenomenos de redundancia entre genes de la familia. En esta tesis, atendiendo a la localizacion de las inserciones respecto a los genes R2R3-MYB se ha analizado en mayor detalle los mutantes Atmyb 14-1 y Atmyb 56-1, en los que se comprobó la ausencia de transcrito de sus genes silvestres mediante técnicas de RT-PCR. El analisis de expresión efectuado mediante ensayos de actividad GUS apunta hacia la expresión especifica de AtMYB56 en apices radiculares y en la base del hipocotilo. La expresión ectópica en plantas de A.thaliana de dicho gen produce efectos pleiotrópicos entre los que se encuentran el menor tamaño de raices y parte aerea, la perdida de dominancia apical y las hojas curvadas sobre si mismas. El analisis fenotípico del mutante nulo Atmyb56-1 mostro reducciones en el crecimiento radicular anque no se ha podido confirmar(ni descartar) que dependan de la mutacion en AtMYB56. Este conjunto de resultados es competible con un papel de AtMYB56 en procesos de division celular. Los experimentos llevados a cabo con plantas transgenicas que portaban fusiones traduccionales del gen delator uidA con secuencias reguladores AtMYB14 permitieron localizar su actividad en los pices radiculares y en el meristemo apical. También se comprobo que esta actividad se inducia por adición exogena del regulador de crecimiento citoquinina, implicado en procesos como la división celular, la fotomorfogénesis y la prevención de senescencia. El análisis fenotípico detallado del mutante Atmyb14-1 reveló sintomas de senescencia acelerada respecto a plantas testigo. El estudio multigeneracional llevado a cabo reflejó una clara desventaja reproductiva del alelo Atmyb14-1 frente a su alelo silvestre. Estos resultados sugieren la implicacion de AtMYB14 en la prevención de senescencia.