New glycomimetic ligands targeting human glycosyltransferases

Resumen

-Introducción Las glicosiltransferasas (GTs) son enzimas ubicuos, presentes en todas las células tanto procariotas como eucariotas. Estos enzimas son responsables de la transferencia de un resto de azúcar desde un sustrato donor a otro aceptor formando un nuevo enlace glicosídico. El papel de estos enzimas es extremadamente importante y participan en un elevado número de procesos bioquímicos que van desde la biosíntesis de polisacáridos, bien estructurales o para el almacenamiento de energía, hasta la modificación post-translacional de proteinas para dar complejos glicoconjugados implicados en el reconocimiento celular o en otros muchos procesos bioquímicos.[1-2] El mal funcionamiento de estos enzimas está en el origen de problemas de salud muy relevantes y son un tema importante de investigación, a juzgar por el creciente número de trabajos científicos que sobre este tema se han publicado en las dos últimas décadas[3-5]. Existen varios criterios de clasificación de glicosiltransferasas, según su estructura (folding), según sustrato o bien según el mecanismo catalítico. En esta tesis hemos trabajado con dos enzimas cuyos sustratos son un glicosilpirofosfato unido a un resto de nucleósido (donor tipo Leloir). Los Enzimas estudiados en esta Memoria han sido: OGT La enzima OGT transfiere un resto de N-acetilglucosamina desde el donor UDP-N-acetilglucosamina a un residuo de serina o treonina de un péptido o proteína, con inversión de configuración.[6-7] Es un enzima esencial para la proliferación celular en los mamíferos y tiene importantes implicaciones en la salud humana, estando su actividad relacionada con diversos tipos de cánceres y enfermedades como Parkinson, Alzheimer y diabetes.[4, 8] GalNAc-T2 Este enzima, localizado en la membrana del aparato de Golgi, es responsable de la transferencia de N-acetilgalactosamina desde el donor UDP-GalNAc a residuos de serina o treonina en proteínas, con retención de configuración[9] Pertenece a una amplia familia de N-acetilgalactosamino transferasas y estructuralmente es un enzima metalo-dependiente. Esta familia está involucrada en la O-glicosilación de glycanos presentes en la superficie celular, y su modificación se asocia con defectos en órganos, enfermedades autoinmunes y algunos tipos de cáncer y metástasis.[10-11] En la bibliografía se han descrito distintos tipos de inhibidores para glicosiltransferasas generalmente basados en la estructura del sustrato donor, introduciendo modificaciones en los distintos fragemntos que la componen.[12-16] En la estructura de los inhibidores descritos podemos encontrar modificacionbes que afectan a la estructura del azúcar que se transfiere, a la naturaleza del enlace glicosídico, a la cadena de pirofosfato así como al resto de nucleósido, tanto a la ribosa, como a la base nitrogenada. También se han descrito inhibidores bi-sustrato que mimetizan la estructura de donor y aceptor unidos, así como otros no basados en la estructura de los sustratos. A pesar del trabajo realizado, los inhibidores descritos para OGT muestran baja especificidad y permeabilidad celular, además de su toxicidad, no siendo apropiados para aplicaciones in vivo. Por otro lado, hasta la fecha, no se ha descrito ningún ligando que muestre actividad inhibidora frente a GalNAc-T2. -Memoria C-Glicosylglicomiméticos En este capítulo se describe la preparación y propiedades biológicas de los C glicosil-glicomiméticos. Tras el estudio del correspondiente análisis retrosintético, la preparación de los ligandos mostrados en la figura 2 se llevó a cabo considerando tres etapas clave en el proceso que suponen: a) glicosilación radicalaria con un resto alilo del azúcar protegido correspondiente, [17] b) hidrofosfonilación fotoinducida del alqueno resultante[18] y c) acoplamiento del grupo fosfonato con un derivado de uridina adecuadamente protegido[19] Estudios biológicos y análisis computacional. Con el fin de evaluar la capacidad de los compuestos preparados para actuar como ligandos de OGT y de GalNAc-T2, se llevaron a cabo estudios biológicos y computacionales: Resultados con Homo sapiens OGT Las medidas de polarimetría de fluorescencia de los derivados de glucosa y de N acetilglucosamina, únicos utilizados con este enzima, indicaron una inhibición muy pobre, con Ki en el rango mM, siendo inferior en el segundo caso, a pesar de su mayor parecido con el sustrato natural. Al no disponer de estructuras cristalinas con los ligandos sintetizados, se llevó a cabo un estudio de docking (Glide) empleando el complejo de OGT humana con el ligando natural UDP-GlcNAc (PDB ID: 4GZ5) como modelo. La superposición de la estructura obtenida para el ligando derivado de glucosa con el sustrato natural, mostró que el resto de uridina se colocaba en el mismo sitio y con interacciones similares, sin embargo, la presencia de únicamente el grupo fosfonato no fue suficiente para mantener el resto de la molécula que quedaba desplazada de la posición esperada. En el caso del derivado de N-acetilglucosamina se encontró una situación similar, con una posición para el carbohidrato todavía más distorsionada. El estudio realizado parece indicar que el grupo fosfonato tiende a ocupar la posición correspondiente al grupo β-fosfato eliminado. Resultados con Homo sapiens GalNAc-T2 Con este enzima se utilizaron los ligandos que portaban los restos de azúcar de galactosa y N acetilgalactosamina. Las constante de disociación medidas estuvieron en el rango de μM (269 y 800) resultando mejor la correspondiente al derivado de galactosa. Por otro lado, sólo se encontraron pequeñas variaciones en presencia o ausencia de Mn2+, cofactor del enzima, lo que indicaba que la interacción con el grupo fosfonato no jugaba un papel relevante en la interacción. En este caso, fue posible resolver la estructura cristalina de un complejo del derivado de galactosa coordinado con el enzima en su conformación inactiva. (PDB ID: 5FV9) El análisis de la estructura cristalina reveló que no había una interacción directa del grupo fosfonato con el ion Mn2+ ni con otros grupos, lo que confirmaba que ese grupo no era el responsable de la unión y justificaba la pequeña variación de las medidas de Kd en presencia o ausencia del ion. Los resultados sugieren que aunque los derivados preparados son ligandos débiles para GalNAc-T2, la estrategia sintética estudiada puede resultar útil para conseguir glicomiméticos que se sitúen en el centro activo del enzima. También se llevaron a cabo estudios de docking con el fin de justificar las diferencias de Kd entre los derivados de galactosa y de N acetilgalactosamina, y de dinámica molecular para entender el papel del loop flexible en los cambios de orientación del substrato UDP-GalNAc al pasar el enzima de la conformación abierta (inactiva) a la cerrada (activa). Pirrolidinglicomiméticos En este capítulo se describe la preparación y propiedades biológicas de los pirrolidin-glicomiméticos. De forma similar al capítulo anterior, la preparación de los ligandos se llevó a cabo considerando tres etapas clave en el proceso que suponen: a) alilación nucleófila de una nitrona cíclica, b) hidrofosfonilación fotoinducida del alqueno resultante[18] y c) acoplamiento del grupo fosfonato con un derivado de uridina adecuadamente protegido.[19] Estudios biológicos y análisis computacional. Los productos preparados se sometieron a una serie de estudios biológicos y computacionales para evaluar su capacidad como frente a OGT y GalNAc-T2: Resultados con Homo sapiens OGT Las medidas de polarimetría de fluorescencia indicaron que los pirrolidinil derivados con grupos OH libres eran inhibidores débiles, con Ki en el rango mM. Sin embargo, los derivados bencilados mostraron valores mucho más bajos, llegando a 87.9 μM para el compuesto con tres grupos bencilo. A pesar de los valores tan interesantes encontrados, no fue posible obtener ninguna estructura cristalina, por lo que como en el capítulo anterior se llevaron a cabo simulaciones de docking molecular (Glide), comparando con el ligando nativo UDP-GlcNAc. Los resultados obtenidos indican que los derivados son grupos OH se unen débilmente, mientras que la fuerza de unión aumenta conforme lo hace el número de grupos bencilo. Estos grupos se unen al enzima mediante interacciones lipofílicas, situándose en el lugar que ocupa el azúcar en el complejo con el sustrato natural. Resultados con Homo sapiens GalNAc-T2 Hasta el momento no se dispone de datos sobre la actividad biológica de los pirrolidinil derivados preparados, por lo que sólo se presentan los estudios de docking molecular realizados. Se observó que, tanto en la conformación abierta (inactiva) del enzima, como en la conformación cerrada (activa), en todos los compuestos el resto de uridina se presentaba en con una orientación y ocupando una posición con interacciones similares a las del sustrato natural. Por el contrario, el anillo de pirrolidina aparecía desplazado de la posición ocupada por el azúcar en el sustrato natural. Los grupos bencilo resultan demasiado voluminosos y a pesar de poder dar interacciones lipofílicas, son orientados fuera del sitio activo cuando hay más de uno, sobre todo en la conformación cerrada. De acuerdo con estos estudios, se espera una baja afinidad entre la enzima GalNAc-T2 y los pirrolidinilglicomiméticos preparados. Inhibidores bisubstrato Recientemente se han descrito complejos de GalNAc-T2 con glicopeptidos sintéticos que muestran la posibilidad de conectar el subdominio α de lectina con el sitio catalítico en el enzima. A partir de esta idea, se prepararon una serie de aminoácidos que podían ser incorporados a péptidos mediante técnicas de síntesis en fase sólida, y que portaban un resto de uridina con capacidad para interaccionar en el sitio activo de GalNAc-T2. Una vez preparados, los aminoácidos con la cadena alquílica como linker, se incorporaron a péptidos con la secuencia adecuada para interaccionar con el dominio de lectina de GalNAc-T2 y finalmente fue posible resolver la estructura del complejo entre el enzima y el péptido GTTP[C10]PVPTTST[TG]SA donde [C10] representa el residuo de Cys modificada, portadora del resto de uridina, y [TG] representa un residuo de Thr glicosilado con un resto de GalNAc. Los ensayos biológicos con los péptido preparados mostraron que no solo no poseían actividad inhibitoria, sino que además se comportaban como substratos aceptores para GalNAc-T2. Movidos por las interacciones lipofílicas encontradas entre el enzima y el linker alquílico en la estructura resuelta, se decidió preparar una serie de cisteínas funcionalizadas con grupos aromáticos con el fin de favorecer las interacciones π-π stacking con Phe280 del enzima El aminoácido portador del anillo de piridina se incorporó a un péptido con la secuencia adecuada (GAAP[C15]PVPAAAA[TG]AA donde [C15] representa la cisteína funcionalizada) que en los ensayos in vitro se mostró como inhibidor con IC50 en el rango de µM. Con los aminoácidos portadores de anillos de quinolina y tiofeno también se prepararon los péptidos análogos que mostraron todavía mejores valores de IC50, siendo 255.1 y 75.8 µM respectivamente. Estos resultados representan el primer caso descrito de inhibición de GalNAc-T2. -Resultados Se ha sintetizado una primera familia de inhibidores basada en derivados de azucares, acta a mimetizar el sustrato natural. Una segunda familia ha sido preparada de la misma maniera basada en derivados de pirolidinas; a su veces preparadas a partir de nitronas. Se ha en fin estudiado la posible actividad de estos compuestos mediante un estudios computacionales ensayos biológicos con OGT y GalNAc-T2. Una segunda vía específica para GalNAc-T2 consiste en la inhibición de la enzima a través de bisustratos: glicopéptidos contenientes aminoácidos modificados. Se sintetizaron nuevos aminoácidos modificados que fueron empleado con éxito en la síntesis de péptidos en fase solida dando lugar a tres nuevos inhibidores de tipo bisustrato. -Discusión Utilizando como modelo los carbohidratos activados naturales UDP-GlcNAc y UDP-GalNAc, ambos sustratos de las glicosiltransferasas humanas OGT y GalNAc-T2, se ha desarrollado una metodología para la síntesis de dos series de derivados conjugados con uridina a través de un fosfonato, dando lugar a compuestos no hidrolizables y más estables que contienen C-glicósidos o un anillo de pirrolidina. Se ensayó la actividad de la primera de las series frente a ambas glicosiltransferasas. En el caso de hOGT, realizado en colaboración con el grupo del Prof. D. M. F. van Aalten, se observó un reducido poder inhibitorio, siendo los mejores valores de Ki de 703 y 4540 μM para los derivados de glucosa y glucosamina respectivamente. En colaboración con el grupo del Dr. R. Hurtado-Guerrero, se ensayaron estos derivados frente a GalNAc-T2. Los mejores resultados se obtuvieron para los compuestos derivados de galactosa y galactosamina, dando unas constantes de disociación de 269 ± 40 y 800 ± 10 µM en ausencia, y 254 ± 20 y 915 ± 180 µM en presencia de Mn2+ respectivamente. Además, fue posible resolver una estructura cristalina del complejo del derivado de galactosa con la conformación inactiva de GalNAc-T2, en la que se pueden observar las interacciones que se establecen entre la unidad de carbohidrato en la forma abierta de la enzima. A pesar de la baja afinidad que presentan estos compuestos, estudios in silico realizados en colaboración con el grupo de la Dra. S. Martín-Santamaría mostraron la importancia de la unidad de uridina durante el cierre del loop flexible, confirmando que el fragmento de uridina-fosfonato-α es un modelo válido para construir ligandos de GalNAc-T2. Desafortunadamente, tanto los estudios biológicos como computacionales señalaron que ambas enzimas requieren del grupo fosfato en β para establecer interacciones más fuertes con los residuos circundantes (en el caso de OGT) o el átomo de Mn2+ (en el caso de GalNAc-T2). Los derivados de pirrolidina permitieron estudiar el efecto de los glicomiméticos con los grupos hidroxilo libres o bencilados sobre las dos enzimas. Pese a que todavía no se dispone de resultados experimentales sobre GalNAc-T2, los ensayos de inhibición preliminares con OGT de los derivados con dos y tres grupos benciloxi dieron unos valores de Ki de 144.9 y 87.9 µM respectivamente. Estos resultados confirman que los derivados bencilados que cuentan con el fragmento uridina-fosfonato conforman una estructura adecuada para el desarrollo de ligandos de hOGT. Por último, se ha llevado a cabo la preparación de una serie de ligandos bisustrato para GalNAc-T2 que han mostrado poder inhibitorio. En colaboración con el grupo del Dr. F. Corzana, se incorporaron los primeros aminoácidos no proteinogénicos (con uridina) en péptidos, obteniendo los ligandos bisustrato. La estructura de un cristal del complejo con GalNAc-T2 sugirió la posibilidad de aumentar la afinidad de estos ligandos bisustrato a través de la incorporación de grupos aromáticos. El estudio de su actividad biológica, hecha en colaboración con el Dr. H. Clausen, mostró que estos derivados son capaces de inhibir GalNAc-T2, obteniendo el mejor resultado para el derivado de tiofeno con un valor de IC50 de 75.8 µM, siendo los primeros inhibidores de GalNAc-T2 descritos hasta la fecha. Además, en base a su diseño racional, se espera que sea un inhibidor específico de la isoforma T2 de entre la veintena de isoformas de GalNAc-T presentes en células de mamíferos. -Bibliografía [1] A. Chang, S. Singh, G. N. Phillips Jr, J. S. Thorson, Curr. Opin. Biotechnol. 2011, 22, 800-808. [2] X. Zhang, Y. Wang, J. Mol. 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