Métodos rápidos microbiológicos y de inmunoensayo para la determinación de residuos de antibióticos y sulfamidas en miel

Resumen

La presencia de residuos de antibióticos en la miel ha generado una creciente preocupación dada su repercusión sobre la Salud Pública. Su detección constituye uno de los principales objetivos de las autoridades sanitarias, por lo que se hace necesario el desarrollo de métodos analíticos que permitan la obtención de datos fiables. En este trabajo se han puesto a punto y validado cuatro métodos de cribado o screening para detectar residuos de penicilina-G sódica, estreptomicina sulfatada, tetraciclina y sulfametazina en miel, siguiendo los criterios establecidos en la Decisión de la Comisión 2002/657/CE. Además, se han analizado 92 muestras de miel españolas con diferentes orígenes geográficos y botánicos para determinar la incidencia de dichos antibióticos en muestras de miel procedentes del mercado español, y evaluar el riesgo sanitario asociado a su presencia. La técnica de cribado en placa evaluada, implica la dilución de las muestras de miel en una solución tamponada (tampón fosfato 0,1 M a pH 7) para neutralizar su acidez natural y alcanzar un pH final de la disolución mayor o igual a 6, valor necesario para la obtención de halos de inhibición significativamente similares. Para la validación del método se ha realizado un estudio de estabilidad, especificidad, linealidad y precisión mediante el análisis cuantitativo en tres días diferentes de seis muestras de miel fortificadas a seis concentraciones de cada antibiótico. La repetibilidad y reproducibilidad del método han mostrado C.V. para cada antibiótico conformes con los valores requeridos en la Decisión Europea 2002/657/CE, y el método ha resultado lineal en el intervalo de concentraciones estudiado de cada antibiótico, con coeficientes de correlación entre 0,980 y 0,997. La concentración menor de cada antibiótico cuyo resultado ha sido positivo (¿ 2 mm) y preciso, ha definido la concentración mínima detectable por el método, y ha correspondido con 50 ppb para penicilina-G sódica, 3.000 ppb para estreptomicina sulfatada, 700 ppb para tetraciclina y 75 ppm para sulfametazina. El análisis de miel mediante el test de inhibición microbiológica Eclipse 50, ha requerido de una dilución en agua destilada estéril, neutralizando el pH de la disolución final con NaOH 1 M hasta 7, valor óptimo para el desarrollo de la prueba. Al tratarse de un método cualitativo, la validación se ha basado en un estudio de estabilidad y especificidad, y en la determinación del límite de detección cualitativo a partir de las representaciones gráficas de la probabilidad de obtener resultados positivos a ocho niveles de concentración de cada antibiótico. Los límites de detección de esta técnica han sido las concentraciones a las que sólo existe una probabilidad del 5% de obtener resultados falsos negativos, y han correspondido con 11,5 ppb para penicilina-G sódica, 24.895 ppb para estreptomicina sulfatada, 575 ppb para tetraciclina y 1.996 ppb para sulfametazina. El nivel de ajuste de las representaciones gráficas ha sido satisfactorio, con unos niveles de significancia menores a 0,05. Los análisis de miel mediante el kit Eclipse 100 han puesto de manifiesto colores similares a los desarrollados en el kit Eclipse 50, pese al lavado de los pocillos con agua destilada para eliminar la miel, y el tiempo de análisis se ha duplicado (4 horas 30 minutos frente a 2 horas 30 minutos para el kit Eclipse 50). El análisis de miel mediante el kit Ridascreen-tetraciclina, no ha requerido de una extracción en fase sólida con columnas RIDA C18, ha bastado con una simple dilución en tampón PBS. La validación de la técnica se ha basado en un estudio de estabilidad, especificidad, y precisión mediante el análisis cuantitativo en tres días diferentes de seis muestras de miel fortificadas a 100 y 400 ppb de tetraciclina. Tanto los C.V. obtenidos para cada día y entre días, como los porcentajes de recuperación para ambos niveles de fortificación, han estado conformes con los valores requeridos en la Decisión Europea 2002/657/CE, por lo que este método se ha utilizado como un método de semicuantificación de tetraciclina en muestras de miel para niveles de fortificación mayores de 7,5 ppb (límite de cuantificación de la técnica). El análisis de residuos de estreptomicina en miel mediante el kit Ridascreen-estreptomicina, ha precisado doble centrifugación de la muestra a 3.000 rpm durante 20 y 10 minutos, respectivamente, extracción en fase sólida con columnas RIDA C18 eluyendo con 1 ml de metanol. Dado que los porcentajes de recuperación no han sido satisfactorios (23,5-137%), se han estudiado los parámetros de funcionamiento cualitativo del método. El límite de detección cualitativo, proporcionado por la concentración a la que sólo el 5% de los resultados pueden ser falsos negativos, ha correspondido con 97,7 ppb para estreptomicina, y el nivel de ajuste de la representación gráfica ha presentado un nivel de significancia menor a 0,05. Mediante la metodología descrita en esta tesis, se han analizado 92 muestras comerciales de miel procedentes del mercado español, para conocer la incidencia de penicilina-G sódica, estreptomicina sulfatada, tetraciclina y sulfametazina en ellas. Tres muestras han presentado residuos de estreptomicina por encima del límite de cuantificación del kit Ridascreen-estreptomicina, y cuatro residuos de tetraciclina por encima del límite de cuantificación del kit Ridascreen-tetraciclina. Comparando las IDE con los valores establecidos de IDA, se observa que, en todos los casos, éstas son inferiores al 4% de las admitidas, lo que supone un riesgo toxicológico muy bajo para el consumidor de miel.