Resistencia a beta-lactámicos y fluoroquinolonas en Salmonella enterica. Mecanismos moleculares y elementos de movilización génica stars

  1. Toro Hernando, María de
Dirigida por:
  1. Carmen Torres Manrique Directora
  2. Yolanda Sáenz Domínguez Directora

Universidad de defensa: Universidad de La Rioja

Fecha de defensa: 19 de abril de 2013

Tribunal:
  1. Francisco Javier Castillo García Presidente/a
  2. Myriam Zarazaga Chamorro Secretaria
  3. María Rosario Rodicio Rodicio Vocal
  4. Patrícia Alexandra Curado Quintas Dinis Poeta Vocal
  5. Jordi Vila Estapé Vocal
Tesis doctoral con
  1. Mención internacional
Departamento:
  1. Agricultura y Alimentación

Tipo: Tesis

Repositorio institucional: lock_openAcceso abierto Editor

Resumen

Salmonella enterica es un importante patogeno zoonotico frecuentemente implicado en toxiinfecciones alimentarias y la emergencia de aislados clinicos resistentes a los antibioticos supone graves limitaciones para su tratamiento. Por ello, el primer objetivo de esta tesis fue estudiar el fenotipo de resistencia a antibioticos y su relacion con el serotipo en los 280 aislados de S. enterica recogidos en el Hosp. San Pedro de Logrono (2007-2009) y Hosp. Clinico Universitario Lozano Blesa de Zaragoza (2009-2010). Los serotipos mayoritarios fueron Typhimurium (52%) y Enteritidis (33%), estando S. Typhimurium altamente asociado con fenotipos de multirresistencia y especificamente con la resistencia a ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina, sulfamidas y tetraciclina (ACSSuT, 29,5%). Se detectaron bajos porcentajes de resistencia a ciprofloxacina o cefalosporinas de tercera generacion. El segundo objetivo fue caracterizar los mecanismos de resistencia a beta-lactamicos (y a otros antibioticos) en los 203 aislados de S. enterica resistentes a ampicilina (AMPR) obtenidos en hospitales de cinco comunidades autonomas (incluidos los dos anteriormente indicados). Se detecto sensibilidad a amoxicilina-acido clavulanico (AMCS) en 79 de estos aislados y sensibilidad intermedia o resistencia (AMCI/R) en 124 aislados. El gen blaTEM-1 se identifico fundamentalmente en los aislados con fenotipo AMPR-AMCS y los genes blaOXA-1 o blaPSE-1 en los aislados AMPR-AMCI/R. En el 59% de los aislados AMPR se detectaron integrones de clase 1 con 12 estructuras distintas, siendo mayoritarias las estructuras aadA2/blaPSE-1 (55%) y blaOXA-1-aadA1 (32%). Siete integrones de clase 1, cuatro de ellos carentes de la region 3'- conservada, albergaban genes dfr de resistencia a trimetoprim. El integron estX+psp+aadA2+cmlA1+aadA1+qacH+IS440+sul3+orf1+mef(B)?IS26 se detecto en un aislado S. Typhimurium y el integron In37 de estructura aac(6')-Ib-cr+blaOXA-1+catB3+arr3 con el promotor PcWTGN-10 inusual en un aislado de S. Thompson. Se observo el fenotipo de pentarresistencia ACSSuT, asociado a los genotipos mayoritarios blaPSE-1-floR-aadA2-sul1-tet(G) o blaOXA-1-catA-aadA1/strA-strB-sul-tet(B). El tercer objetivo se centro en caracterizar los 65 aislados blaPSE-1-positivos, todos ellos S. Typhimurium, obtenidos en el objetivo anterior. La Isla Genomica de Salmonella de tipo 1 (SGI1), portadora de los genes blaPSE-1, floR, aadA2, sul1 y tet(G), se detecto en todos los aislados, identificandose una nueva variante de SGI1 (GenBank JF775513). Todas las cepas blaPSE-1-positivas presentaron pulsotipos indistinguibles o altamente relacionados (PFGE, enzimas XbaI, SpeI) y fueron adscritas a la secuencia tipo ST19 (Complejo Clonal CC1). La deteccion de genes de virulencia agrupo a las cepas en tres virulotipos; detectandose el mayoritario en el 89% de las mismas e incluyendo genes localizados en islas de patogenicidad, en el plasmido de virulencia o relacionados con profagos. El cuarto objetivo fue estudiar los 11 aislados que presentaban un fenotipo de betalactamasa de espectro extendido (BLEE) o AmpC y que se asociaron a los genes blaCTX-M-9 (serotipo Virchow, 2 aislados), blaCTX-M-10 (Virchow, 2), blaCTX-M-14a (Enteritidis, 1), blaCTX-M-15 (Gnesta, 1, y S. enterica grupo C, 1), blaSHV-2 (Livingstone, 1), blaSHV-12 (Enteritidis, 1) y blaCMY-2 (Bredeney, 2). Plasmidos de tipo IncI1 o IncA/C portaban los genes blaCTX-M-14a, blaCTX-M-15, blaSHV-2, blaSHV-12 o blaCMY-2; mientras que el gen blaCTX-M-9, incluido en un integron complejo In60, y el gen blaCTX-M-10, presente en un entorno relacionado con fagos, se encontraron en plasmidos no tipables. La transferencia por conjugacion de los genes BLEE/AmpC resulto positiva en 8 de las 11 cepas estudiadas, cotransfiriendo otros genes de resistencia adicionales en la mayoria de los casos. Se realizaron experimentos de estabilidad del fenotipo BLEE/AmpC tras 100 pases consecutivos en ausencia de presion selectiva antibiotica. Cinco de las cepas analizadas, portadoras de los genes de resistencia blaCTX-M-14a, blaCTX-M-15, blaSHV-2, blaSHV-12 y blaCMY-2, perdieron la copia plasmidica del gen. En dos de estos casos se evidencio la perdida completa del plasmido IncI1 portador del gen blaCMY-2 o blaSHV-12. Otros genes de resistencia, tales como tet(A), tet(B), y los integrones portadores de los genes dfrA12 y dfrA16, se perdieron en dos cepas adicionales. El quinto objetivo fue la caracterizacion en profundidad del unico aislado (S. Typhimurium Se20) resistente a ciprofloxacina obtenido en esta tesis. Correspondio a un caso clinico de seleccion in vivo de resistencia a fluoroquinolonas y aminoglucosidos, asociado a la adquisicion gen aac(6')-Ib-cr4, tras 7 dias de tratamiento con ciprofloxacina. Tras comprobar mediante PFGE y MLST que las cepas pre- y post-tratamiento pertenecian al mismo clon, se realizo la caracterizacion de los mecanismos moleculares de resistencia implicados. Se determino la localizacion genetica de los determinantes de la resistencia, detectando los plasmidos portadores, y se comprobo mediante experimentos in vitro la transferencia por conjugacion de los mismos. Este trabajo supone la primera evidencia de seleccion in vivo de resistencia a fluoroquinolonas y aminoglucosidos en S. Typhimurium portadora del gen qnrS1 y aac(6')-Ib-cr4 y con mutaciones en la proteina GyrA. Por ultimo, se caracterizo el plasmido de pequeno tamano portador del gen aac(6')-Ib-cr4, que se denomino pMdT1 (GenBank JX457478).